Oncologia Relatórios

Introdução

Apesar de novas terapias recentemente beenintroduced na prática clínica para o tratamento de advancedprostate câncer, o câncer de próstata continua a ser a segunda deadliestcancer em homens nos Estados Unidos em 2014 (1). São urgentemente necessários novos objectivos terapêuticos e estratégias para melhorar ainda mais o resultado clínico dos pacientes com cancro da próstata.

um potencial alvo terapêutico promissor, é a potencial quinase dependente da isciclina 5 (CDK5). CDK5 é um cinasestruturalmente semelhante a outros CDKs (2). O CDK5 não parece ter um major role na regulação do ciclo celular (3,4). Foi bem caracterizada pelo seu papel dominante no desenvolvimento do sistema nervoso central, incluindo funções de migração, diferenciação e adesão por país (5,6). Weand others subsequently showed that CDK5 plays an important role incancer development and metastasis (7-12). No estado das células cancerígenas, demonstrámos que o CDK5 era fundamental para a integridade do esqueleto, a migração e invasão celular e o invivo, para metástases (7). Cancro empancreático, o CDK5 é intrínseco ao KRAS sinalizando através da importante via de transdução do sinal RAL, proporcionando assim um potencial alvo “suggable” para tumores Kras mutantes (8). Em conjunto, estes estudos indicam que a proibição do CDK5, isoladamente ou em combinação com outros agentes, proporciona uma estratégia terapêutica eficaz para estes e outros tipos de cancro.

no presente estudo, Definimos para identificar os agentes que seriam particularmente eficazes em combinação com a inibição Cdk5 nas células cancerígenas da próstata. Por isso, fizemos uma interpretação da Johns Hopkins Drug Library (JHDL). A JHDL é uma recolha de 3.360 compostos farmacêuticos que têm sucesso nos testes de segurança completos em seres humanos para uma variedade de aplicações(13,14). Esta biblioteca tem sido utilizada com sucesso para a reprogramação de compostos para a terapia do cancro,incluindo a identificação da digoxina como um inibidor HIF1a (15), e do itraconazol como um angiogenesisinibitor (16). Anteriormente, empregámos a JHDL para identificar o brometo de cetrimónio e os níveis de irinotecano associados ao aumento da actividade antitumoral contra os cancros da próstata que expressam níveis baixos do gene supressor de metástase n-mycdownregled gene 1 (NDRG1) (17).Aqui, nós realizamos uma triagem JHDL semelhante com cancercells da próstata que diferem na atividade CDK5. A tilorona foi identificada como uma combinação com células de cancro da próstata com letalidade sintética in vitro deficientes em inCDK5.

materiais e métodos

cultura celular

linhagens de células de cancro da próstata PC3 foram obtidas a partir daatcc. Estas células são derivadas de uma metástase óssea de um paciente com 62 anos de idade com cancro da próstata. Os fibroblastos da próstata humana, cindlyproblastos fornecidos pelo Dr. J. Isaacs, foram obtidos a partir de uma biópsia da próstata em um paciente com câncer de próstata de 62 anos com uma pontuação de Gleason de 4. As linhas de Bothcell foram cultivadas e mantidas em meio RPMI-1640 (Invitrogen)suplementadas com 10% de soro fetal bovino. As células eram culturedidas numa incubadora humidificada a 37°C numa Co2atmosfera de 5%.

Criação do PC3 CDK5dn célula de linha

Perda da CDK5 função foi realizado no PC3 cellsby de transfeccao de uma posição dominante-negativo construir contendo um D144Nmutation, gentilmente cedido pelo Dr. L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). O protocolo utilizado foi descrito anteriormente (7). Em resumo, o construct foi subclonado em um vetor Tet bidirecional, pBI-EGFP(Biosciences BD), que tinha um gene de resistência zeocin adicionado para a seleção (gentilmente fornecido pelo Dr. K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School of Medicine). o vector PBI-EGFP vazio ou o vector pBI-EGFPCDK5dn foi transferido para células PC3 que continham a construção do promotor aTet-Off, pTTa (Biociências BD).

Western blotting

Western blotting foi realizado como descrito anteriormente (19). 10 microgramas de propetina foram carregados no gel. Os anticorpos primários foram dissolvidos em tampão de bloqueio . Uma diluição de 1:1000 foi utilizada para anti-CDK5 (Sigma-Aldrich); anti-vinculina (Millipore,Norte) foi diluída de 1:4,000. Os anticorpos secundários foram diluídos a uma diluição de 1:4,000. A normalização da intensidade da banda foi realizada com a proteína vinculina da governanta. Desenvolveram blots usando um scanner Microtek.

teste de cicatrização de feridas

ensaios de cicatrização de feridas foram realizados com controlo de confluentPC3 (contendo o vector pBI-EGFP vazio) ou células CDK5dncells PC3. Um raspador com ponta de borracha foi usado para raspar uma área de conchas. Imagens microscópicas de luz foram captadas imediatamente e 24 raspagens de hafter.

crivagem de bibliotecas de pequenas moléculas

a biblioteca JHDL foi descrita anteriormente (13,14,17).O armazenamento e o rastreio de compostos JHDL foram efectuados como descrito anteriormente (17).Brevemente, as células de controlo PC3 e CDK5dn foram semeadas em placas de 96 poços(1×103 células/poço) e autorizadas a aderir durante a noite. Então 5 µl de drogas, armazenadas como soluções de reserva de 200 µM inDMSO/H2O, foi adicionado ao meio RPMI completo, de modo que células foram tratadas a uma concentração final de 10 µM. Após 48 h de tratamento, foram adicionados a eachwell 20 µl de reagente MTS do ensaio de proliferação de células Aqueousnão radioactivas do triturador de células 96™ durante um período de 2-4 h a 37 ° C. As placas foram analisadas usando asoftmax Pro plate reader (dispositivos moleculares). A proliferação de células tratadas foi comparada com a proliferação de células PC3control ou CDK5dn tratadas com DMSO (Índice de proliferação). Osindícios de proliferação das células CDK5dn PC3 foram comparados com osindícios de proliferação das células de controlo PC3. Foi realizado um estudo PubMed para avaliar a utilização clínica de potenciais resultados positivos.

testes de MTS

testes de MTS foram realizados para medir o efeito antiproliferativo do tratamento com tilorona. O cloreto de tiloronedi (Sigma-Aldrich) foi armazenado como solução de reserva de 10 mM em DMSO a -20 ° C. Mil células PC3 foram revestidas com placas de 96 alvéolos contendo 100 µl de meio RPMI completo. Com cerca de 50% de confluência, foi administrado dicloridrato de tilorona. Forexperimentos o composto foi diluído em meio RPMI completo para obter a concentração final desejada. Após o tratamento de 72 h (tilorona em monoterapia), foi adicionado reagente MTS, e a absorção a 490 nm foi determinada utilizando um leitor de placas SoftMax Pro.Os índices de proliferação foram calculados; as células PC3 control orCDK5dn (em 103 µl de meio RPMI completos) não tratadas foram usadas como acontrol. Os testes t do aluno foram realizados para avaliar os valores p.Foram efectuados ensaios Clonogénicos

doseamentos Clonogénicos

doseamentos Clonogénicos para avaliar a sobrevivência a longo prazo após o tratamento com tilorona. As células cancerígenas da próstata foram colocadas em pratos de 60 mm e autorizadas a aderir. A 50-60% de confluência,as células foram tratadas com tilorona durante 72 horas. subsequentemente,1×103 células de cada prato foram banhadas em pratos triplicados de 60 mm e incubadas em meio RPMI completo durante 12 dias.As colónias foram fixadas e manchadas com uma solução contendo 90% de metanol e 10% de violeta cristal (2,3% de violeta cristal, 0,1% de oxalato de amónio e 20% de álcool etílico; Sigma). As colónias foram seleccionadas com um scanner informático (Microtek) e contadas manualmente.Os testes t do estudante foram realizados para avaliar se as diferenças entre as linhas celulares eram estatisticamente significativas.Foram realizados ensaios de crescimento 3D

utilizando o sameprotocol como descrito anteriormente (17). Em suma, os esferóides foram gerados por filtração de células PC3 por 16 h como uma gota de suspensão sobre um prato humidificado em uma incubadora de CO2 em mediacontinuando 0,5% de metilcelulose. Os esferóides foram incorporados na matriz de incolagénio (Biociências BD), tratados com tilorona e imaginados com um microscópio Ti Eclipse Nikon (Nikon) no dia do tratamento e seis dias após o início do tratamento. As áreas esferóides e totais (spheroidplus sprouts) foram medidas com ImageJ. Os aumentos de dobra foram calculados dividindo a área esferóide/total no dia 6 por esferóide / área total no dia 0 para cada esferóide individual. Para cada linha de células e ponto de tempo, foram aumentadosvezes de quatro esferóides. Foram realizadas análises estatísticas utilizando os primeiros testes do Estudante.

resultados

supressão da actividade CDK5

células do cancro da próstata PC3 foram escolhidas para o ecrã da cadeia Jhdl devido ao seu potencial altamente metastático e à sua independência em relação aos genes, assemelhando-se assim a um cancro da próstata agressivo resistente aos metastáticos. A actividade do CDK5 foi inibida pela tradução e selecção de uma mutação dominante-negativa (CDK5144N). Estas células CDK5dn do PC3 tinham um nível proteico superior de totalCDK5 em comparação com as células de controlo do PC3 (células PC3 transfectadas com um vector vazio) (Fig. 1A). Um ensaio de cura em série (8) confirmou que o CDK5 estava funcionalmente inactivo nestas células; ao contrário das células de controlo do PC3, as células CDK5dn do PC3 não tinham a capacidade de invadir a superfície raspada (Fig.1B).

ecrã de biblioteca para compostos que visam células pcc3 com base na actividade CDK5

foi realizado um teste de rastreio de alta capacidade para detectar compostos que visam células PC3 com base na actividade CDK5. As células PC3control e CDK5dn foram tratadas com todos os compostos de theJHDL a 10 µM durante 48 horas. Para identificar acertos que seletivamente visavam as células PC3 com base na expressão CDK5, seleccionámos todos os compostos em que a razão do Índice de proliferação (CDK5dn/control) estava abaixo de 0,5 ou acima de 1,5 (Fig. 2A).Além disso, os hits tiveram que inibir a proliferação celular de células PC3 em pelo menos 10%, uma vez que estávamos especificamente interessados em compostos que inibiam o crescimento celular (linha horizontal e vertical no gráfico). Wealso selecionados todos os compostos que inibiu a proliferação de células inPC3 células de 70% (canto inferior esquerdo do gráfico), como nós wereinterested na identificação de potencial altamente eficaz antitumoragents. No total, foram seleccionadas 41 visitas para avaliação complementar.

uma tela secundária foi realizada em que selecionadas da tela primária foram adicionadas a 10 µM para 48 h para células PC3control e CDK5dn em triplicado, para eliminar falsos resultados positivos (Fig. 2B). Os valores de corte foram ligeiramente menos rigorosos do que no ecrã primário; as compounds foram consideradas um êxito quando o rácio de índices de proliferação(CDK5dn/control) era inferior a 0,7 ou superior a 1,4. Isso resultou na identificação de três compostos que seletivamente focam células PC3 que expressam PC3: rutilantina, lactato de etacridina e cloreto de cetalcónio (Fig. 2C).Estes compostos não foram utilizados como agentes antitumorais e a sua utilização clínica potencial como agentes antitumores intravenosos parece limitada (20-23). Outro composto, o tilorone analogR9536-DA, Foi altamente eficaz na inibição de ambas as células ISOGÉNICAS PC3 (inibição>70%), mas inibiu a proliferação de células PC3CDK5dn um pouco mais eficazmente (razão CDK5dn/controlo:0, 687). A tilorona e os seus análogos têm actividade antiviral, actuando pelo menos em parte como indutores do interferão (24-26)e demonstraram também, pré -linica e clinicamente, ter antitumoractividade (27, 28).

tilorona destina-se selectivamente a células PC3 com baixa actividade CDK5

continuamos as nossas experiências com dicloridrato de metilorona recentemente dissolvida. Após 72 h de tratamento com tilorona em várias concentrações, a sua CI50 foi estabelecida em 8-12µM em células CDK5dn PC3 e 15 µM em células de controlo PC3 em ensaios STM(Fig. 3A). Com 8 µM, a proliferationactivity diminuiu em 24% e 47% no controlo PC3 e CDK5dncells, respectivamente (p=0, 001). Para avaliar a toxicidade das células da próstata informal da tilorona, foram realizados ensaios de STM com tratamento tiloronetal de fibroblastos da próstata humana (Fig. 3B). A sensibilidade destas células à totilorona foi semelhante à das células de controlo PC3.

o efeito inibitório da tilorona nas células PC3 foi posteriormente avaliado através da realização de ensaios clonogénicos (Fig. 3C). As células CDK5dn do PC3 foram também significativamente mais sensíveis do que as células de controlo do PC3 à tilorona neste ensaio. O tratamento com tilorona de 10 µM resultou em clonogenicsurvival de 40% nas células CDK5dn PC3 e 72% nas células de controlo PC3(p=0, 002).

foi realizado um ensaio de crescimento esferóide para avaliar o crescimento 3Dtumor e a invasão de células PC3 no tratamento com tilorona(Fig. 4). Tanto as células de controlo PC3 como as células PC3CDK5dn tiveram aumentos comparáveis do tamanho do esferóide ao longo de seis dias. No entanto, o tamanho total (o tamanho das esferóides e rebentos) teve um aumento mais elevado nas células de controlo do PC3, confirmando que as células CDK5dn PC3 tratadas com um potencial invasivo diminuído em comparação com as células de controlo do PC3. Quando a tilorona foi administrada a 5µM, as esferóides de controlo PC3 tiveram um crescimento semelhante e patternas invasivas as células de controlo PC3 não tratadas (p=0, 59) (Fig. 4B, gráfico esquerdo). No entanto, whentilorone foi administrado na mesma concentração para o PC3 CDK5dncells, uma redução significativa tanto na esfera tamanho e total sizewas observado (p<0.01), o que sugere que tilorone successfullyinhibits esfera de crescimento e invasão de PC3 CDK5dn células whenadministered a 5 µM (Fig. 4B, gráfico direito). A 10 µM, ambas as linhas celulares isogénicas tinham um potencial invasivo decreased.

discussão

a JHDL, uma biblioteca de compostos Farmaceuticos bem caracterizados, foi desenvolvida para facilitar os estudos sobre o uso de drogas (29). A extensa toxicidade in vivo e os perfis farmacocinéticos de compostos na biblioteca permitem o rápido desenvolvimento subsequente destes compostos. Vários compostos das JHDL foram obtidos em ensaios clínicos para o cancro e outras aplicações terapêuticas(13,14,16,17,30–32).

no presente estudo, analisámos as JHDL à procura de combinações que inibem diferentemente o crescimento das células cancerígenas na presença da inibição CDK5; a tilorona e um análogo da tilorona foram identificados como agentes que visavam selectivamente as células cancerígenas cdk5 deficientes em Pc3prostato. A tilorona (Amixin IC) é empregada clinicalem alguns países como um agente antiviral activo oralmente (25). A tilorona foi testada em seres humanos para o tratamento de gliomas cerebrais, papilomatose laríngea e cancro do alto (28,33,34).Apesar da eficácia antitumor ter sido notificada, o interesse na terapêutica com tilorone forcancer diminuiu. Recentemente, Zhou et al reportednew tilorone analogs with improved anticancer activity (35). Estes análogos podem ser promissores para a toexamina, particularmente em associação com inibição CDK5.

além da possibilidade de que a tilorona possa ser comprometida em combinação com a inibição CDK5, a identificação da tilorona como um agente que selectivamente atinge células com CDK5 inativo sugere classes potenciais de medicamentos para potenciar a eficácia da inibição CDK5. A tilorona tem sido caracterizada como indutor de aninterferão (24). Esta sugestão de que o próprio interferão, ou um interferonindutor alternativo como o agonista TLR, pode ser útil em associação com o inibidor aCDK5. No entanto, podem estar envolvidos outros mecanismos. Por exemplo, a tilorona também é um agente INTERCALANTE de ADN (24) e pode-se imaginar que pode modular a estrutura cromatina e a expressão genética. Outras funções do tilorone, incluindo a via sinalizadora e a transcrição dasinteracções factor’s (36,37), podem também estar envolvidas. São necessários mais estudos para desvendar o mecanismo exacto de acção através do qual atilorona se dirige selectivamente a células cancerígenas da próstata CDK5-negativas.

agradecimentos

os autores desejam agradecer aos professores P. J. Van Diestand E. Van der WallA. Carducci and J. T. Isaacs for their provision of laboratorymaterials. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Médico de Investigação da hospedeira de bordo, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH-06-1-0139 e NCI Spore grant P50 CA58236. M. D. W. wassupported by the Dr Saal van Zwanenbergstichting and HuygensScholarship Programme.