PMC

1Detailed protocols and troubleshooting tips for all aspects of the GST gene fusion protein expression system are available from GE Healthcare in the handbooks: GST Gene Fusion System, product number 18-1157-58, and the recombinante Protein Handbook, product number 18-1142-75. Os manuais estão disponíveis para compra em papel ou podem ser acessados como PDF no site da GE Healthcare.

2 recomenda-se a utilização de jm105 ou de uma estirpe semelhante para clonagem e manutenção do vector. São recomendadas estirpes de BL21 e seus derivados, ou outra estirpe com deficiência de protease, para a expressão da proteína máxima. As estirpes deficientes em produtos do gene da protease citoplásmica, tais como lon, ompT, degP ou htpR, podem minimizar os efeitos da degradação proteolítica da proteína sobreexpressada pelo hospedeiro. Não utilize uma estirpe de E. coli que transporta o alelo rec1A para propagar plasmídeos pGEX, uma vez que foram notificadas supressões ou rearranjamentos de ADN plasmídeo.

3Glutathione Sepharose 4B é usado neste protocolo de purificação. Este meio de cromatografia é ideal para as condições de triagem e permite uma escala fácil. As purificações são facilmente realizadas utilizando um fluxo de gravidade ou um sistema de cromatografia de baixa pressão, ou podem ser utilizadas em purificações por lotes baseadas na centrifugação. As colunas de afinidade GSTRAP FF são colunas pré-embaladas de 1 ml ou 5 ml que também estão disponíveis e podem ser ligadas em série para aumento de escala. Estas colunas destinam-se a ser utilizadas com um sistema cromatográfico líquido, uma bomba ou seringa. Além destes formatos, a glutationa Sepharose também está disponível em colunas de spin e formatos de placas de 96 alvéolos para o rápido rastreio das condições de expressão e purificação da proteína de fusão GST.

4DFP é uma neurotoxina extremamente perigosa. Siga as precauções fornecidas pelo fabricante e manuseie apenas o reagente puro numa chaminé química.

5adição dos inibidores da protease ao tampão de lise ajudará a prevenir a degradação proteolítica da proteína alvo durante a extracção. No entanto, o cocktail exacto de inibidores da protease adicionados ao tampão de lise deve ser adaptado às características da proteína alvo. Se necessário, devem ser adicionados ao tampão agentes redutores como 2-ME, DTT ou TCEP em concentrações de 1-10 mM. A adição de um detergente não iónico, como o Triton X-100 a 1%, pode também ser adicionada ao tampão para ajudar à extracção.

6seguinte é um protocolo de rastreio para verificar os níveis de expressão proteica da proteína de fusão em mini-culturas. A presença de um aumento dos níveis de proteínas com o peso molecular esperado num gel SDS-PAGE após indução com IPTG é uma boa indicação de uma expressão proteica bem sucedida. Após a indução, deve ser visível uma banda proeminente com a massa molecular esperada (peso molecular da proteína alvo + ~ 26 KDa para a fracção GST). Se se suspeitar que a proteína é expressa em um nível baixo, a verificação da expressão correta pode ser realizada usando Western blotting com um anticorpo específico para a proteína alvo ou GST. Se as amostras não forem analisadas imediatamente pela SDS-PAGE, podem ser conservadas durante a noite a 4 °C ou a -20 °C para armazenamento a longo prazo.

1. inocular várias colónias isoladas em tubos de centrifugação separados de 50 ml contendo 10 ml de LB complementados com 100 µg / ml de ampicilina. Cultiva durante a noite a 37 ° C com agitação.

2. na manhã seguinte, adicionar 0,5 ml de pernoite cultura 4,5 ml de LB com 100 µg/ml de ampicilina. Crescer 1 h a 37 ° C.

3. retirar 1 ml de amostra não induzida. Centrifugar e remover sobrenadante. Congelar ou armazenar em gelo até estar pronto para executar a SDS-PAGE.

4. Adicionar IPTG para uma concentração final de 1 mM e crescer para um adicional de 2-3 h.

5. Retirar 1 ml induzida por exemplo. Centrifugar e remover sobrenadante. Congelar ou armazenar em gelo até estar pronto para executar a SDS-PAGE.

6. Ressuspender as células de pellets de madeira em 200 µl de SDS-PAGE tampão de amostra; o calor 3-5 min a 90 °C.

7. Analisar de 5 a 10 µl usando SDS-PAGE seguido pelo corante azul de Coomassie (ou 1-2 µl para Western blot).

7samplos cultivados em mini-culturas também podem ser utilizados para avaliar a solubilidade de uma proteína de fusão específica (Ver nota 6 para o protocolo de expressão de mini-cultura). No final do período de indução, colher as células por centrifugação. Ressuspender o sedimento em 200 µl de PBS a frio. Lise as células usando sonicação; mantenha a amostra em gelo. Guarde uma pequena alíquota do lisado para análise por SDS-PAGE. Centrifugar a amostra lisada durante 15 minutos. Remover o sobrenadante para um tubo separado. Ressuspender o sedimento em 200 µl de PBS. Analisar alguns dos lisados brutos, o sobrenadante e o sedimento ressuspenso por SDS-PAGE ou Western blotting. Se a amostra for observada tanto na fracção lisada como na fracção sobrenadante, a amostra é adequadamente solúvel. Se a amostra estiver presente principalmente no sedimento lisado e ressuspenso, a amostra é mais provável em corpos de oclusão. Nos casos em que a proteína está localizada em corpos de inclusão, explorar diferentes condições de expressão para mudar a expressão para uma forma solúvel (Ver nota 8).

8 se a proteína de fusão for expressa principalmente em corpos de inclusão (ex. > 80% insolúvel), podem ser utilizadas várias estratégias para melhorar a solubilidade. Muitas vezes, a indução a uma temperatura mais baixa (15-25 ° C) é eficaz no deslocamento da expressão de corpos de inclusão para a fração solúvel. As células induzidas a esta temperatura mais baixa crescerão mais lentamente e necessitarão de períodos de indução durante a noite. Em alguns casos, pode ser necessário o uso de estirpes hospedeiras alternativas ou modificações na construção de plasmídeos. Se a proteína de fusão permanecer principalmente em corpos de inclusão, mesmo após tentativas de obter proteínas solúveis, pode valer a pena aumentar a produção de E. coli e purificar proteínas suficientes a partir da pequena quantidade de proteína solúvel disponível. Em alguns casos, outras marcas de proteínas de fusão devem ser exploradas.

9 baixos níveis de expressão proteica podem ser o resultado de uso raro de codon. Neste caso, a mudança para outra estirpe de E. coli que contém transcrições extra para o raro codon tRNA pode melhorar significativamente a produção de proteínas. Diferentes formulações ou adição de glicose de até 2% também podem melhorar a expressão (13, 14). Se houver suspeita de que a proteína expressa é tóxica para as células (geralmente eles vão parar de crescer após a indução com IPTG), tente induzir em um ponto de tempo posterior por uma menor quantidade de tempo. Diminuir a concentração de IPTG é outra opção que deve ser explorada.

10Monitor cell growth by reading the optical density at 600 nm (A600). Uma cultura noturna deve chegar a um A600 ~1-1. 2. As células devem ser induzidas numa fase inicial da curva de crescimento logarítmico para a E. coli, A600 ~ 0, 5 a 0, 7. A 37 ° C, levará aproximadamente 2 h para que as culturas atinjam um estágio logarítmico inicial de crescimento. Se as células são cultivadas a uma temperatura mais baixa, o tempo de incubação deve ser aumentado, uma vez que as células crescerão mais lentamente a temperaturas mais baixas. Geralmente, o maior rendimento de proteína de fusão será obtido quando as células são induzidas em A600 = ~ 0,5. Após indução com IPTG, as directrizes gerais para o tempo de incubação são as seguintes: 3 h a 37 °C, 5 h a 30 °C e durante a noite a 25 °C ou menos. Colher as células antes da saturação, A600 ~ 1.0-1.2.

11para assegurar um arejamento adequado, os frascos só devem ser preenchidos até 20-30% da sua capacidade.É importante que não estejam presentes na amostra inibidores da protease da serina antes da clivagem com trombina ou factor Xa. Os seguintes inibidores da protease devem ser removidos antes da clivagem da trombina ou do factor Xa: AEBSF, APMSF, antitrombina III, antipaina, α1-antitriptina, aprotinina, quimostatina, hirudina, leupeptina e PMSF. Além disso, a benzamidina é específica para a trombina e o Pefabloc FXa é específico para o factor Xa. Os seguintes inibidores da protease devem ser evitados com a Protease de prescrição: 100 mM ZnCl2, 100 µM quimostatina e 4 mM Pefabloc.Existem vários métodos alternativos para detecção de proteínas de fusão GST. Para proteínas que expressam bem em um alto nível, o método mais simples de monitorar a purificação é através de géis SDS-PAGE manchados com cor Azul Coomassie ou mancha de prata. Uma alternativa para proteínas que se expressam em níveis baixos é usar Western blotting usando um anticorpo direcionado para GST ou a proteína alvo. Uma alternativa para expressões de pequena escala é monitorizar a presença de GST com um teste ELISA ou enzima CDNB.

14Save a small amount of protein sample from each step of the purification, including lysis, sobrenadante, pellet, unbound fractions from sample loading, wash steps, and elution steps to be analyzed by SDS-PAGE or Western blotting. Depois de todas as amostras terem sido analisadas e agrupadas, descartar frações indesejadas.As proteínas

15GST também podem ser purificadas utilizando um método de purificação por lote. Um método de purificação de lotes é rápido, fácil e requer pouco equipamento; no entanto, a proteína resultante pode conter mais impurezas e ter um rendimento inferior ao de uma purificação por cromatografia. As purificações de lotes são melhor utilizadas quando as condições de purificação de triagem. A purificação do lote abaixo descrita é geralmente realizada à temperatura ambiente. Para minimizar o risco de degradação proteolítica, o procedimento pode ser realizado a 4 °C aumentando o tempo de incubação 2 a 4 vezes.

1. células de Lise e obter proteína de fusão solúvel (Ver notas 8 e 21 se a amostra estiver em corpos de inclusão).

2. adicionar 2 ml 50% de slurry glutationa Sepharose matriz a granel (1 ml de volume de leito) por sobrenadante de lisato bacteriano de 100 ml. Incubar 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave.

3. centrifugar 500 × g durante 5 minutos. Remover o sobrenadante e conservar para análise por SDS-PAGE para determinar a eficiência de ligação.

4. lavar a resina com 10 volumes de cama PBS. Ressuspender suavemente e depois centrifugar 500 × g durante 5 minutos. Remover o sobrenadante. Repetir os passos de lavagem e centrifugação para um total de 3 lavagens de 10 volumes de cama cada.

5. Eluir a proteína de fusão, ressuspendendo a resina com um tampão de eluição de 1, 0 ml de glutationa por ml de volume de leito. Incubar 10 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar 500 × g durante 5 minutos. Transferir o sobrenadante contendo proteínas de fusão para um tubo separado. Repetir os passos de eluição e recolha num total de 3 vezes. Os sobrenadantes podem ser agrupados ou analisados separadamente pela SDS-PAGE para monitorizar o teor de proteínas (Ver nota 12).

16A bed volume é igual a metade da suspensão de 50% da glutationa Sepharose 4B utilizada para a purificação. Para preparar um chorume de 50% de glutationa Sefarose (é fornecido como ~ 75% De Chorume): determinar o volume de leito necessário para a escala de purificação. Ressuspender a glutationa SEFAROSE 4B. para cada ml de volume de cama necessário, pipet 1, 33 ml da suspensão a 75% para um tubo de centrifugação de tamanho apropriado. Centrifugar a 500 × g durante 5 minutos. Decantar o porteiro. Lavar com 10 volumes de cama (10 ml por 1, 33 ml de suspensão original) de PBS, invertendo suavemente o tubo várias vezes para misturar, centrifugar 500 × g durante 5 minutos. Decantar o porteiro. A não remoção da solução de armazenamento de etanol pode interferir com os passos de ligação subsequentes. Adicionar 1 ml de PBS para cada 1, 33 ml da suspensão original. Isto resulta numa suspensão de 50%.

17Glutathione Sepharose tem uma capacidade de ligação mínima anunciada de 8 mg / ml. Uma coluna de 20 ml deve ser adequada para purificar a proteína de culturas de E. coli de 3 × 600 ml que contêm ~ 20-40 mg de proteína de fusão por cultura. Tanto a quantidade de resina utilizada como o tamanho da coluna podem ser aumentados ou diminuídos dependendo da quantidade de proteína a ser purificada.

18resuspender o sedimento utilizando 25-50 µl de tampão de lavagem por ml de cultura original.

19Cell disruption is complete when the suspension partially clear and turns a slightly darker color. Evite a espuma durante a sonicação, pois isso pode levar à desnaturação da proteína de fusão. Evite a sobre-medicação, pois isso pode levar à co-purificação das proteínas Hospedeiras de E. coli, juntamente com a proteína de fusão GST. A elevada viscosidade devida à libertação de ácidos nucleicos durante a sonificação pode ser reduzida pela adição de DNase ou benzoase ao tampão de lise. Lisozima até uma concentração de 0.2 mg / ml podem ser adicionados como adjuvante da lise celular. Uma alternativa à sonicação é a utilização de formulações de extracção de células disponíveis no mercado. No entanto, estes produtos podem conter componentes proprietários que interferem com as aplicações a jusante.

20If tentativas de mudança de expressão a partir de corpos de inclusão para a fração solúvel falhar, insolúvel GST de fusão de proteínas, por vezes, pode ser purificado na presença de denaturants como a ureia, seguido por refolding. A solubilização utilizando detergentes como o sarkosil (n-laurilsarosina) também foi utilizada com sucesso (15,16). Embora o protocolo a seguir tenha sido usado com sucesso para desnaturar e re-natureza proteínas de fusão GST, cada construção de proteína de fusão é única e as condições exatas de desnaturação e re-naturação devem ser determinadas empiricamente. Os desnaturantes comuns que foram empregados com sucesso incluem guanidina HCl, ureia, Tween 20, CTAB e SDS (17, 18). Os desnaturantes, então, devem ser completamente removidos para permitir o adequado refluxo da proteína. As condições que devem ser otimizadas para facilitar a remodelação incluem:: tipo de desnaturante, pH, presença de agente redutor, velocidade de remoção do desnaturante e concentração de proteínas. Uma vez que a proteína tenha sido re-naturada, verifique se a proteína recuperou a sua conformação e função nativa e remova qualquer proteína mal dobrada.

1. Pré-equilibrar a glutationa coluna de Sepharose; proceda à sonicação o granulado de E. coli células, e separar o sobrenadante do lisado e bolinha de frações por meio de centrifugação (ver 3.3 Afinidade de purificação da proteína de fusão GST passos 1-8). Ressuspender o sedimento lisado que inclui os corpos de inclusão, em 15 ml de tampão de lavagem. Centrifugar 20 min a 48,000 × g (4 °C). Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento lavado em 12 ml de tampão U (ressuspender em 20 µl de tampão U por ml de cultura original). Incubar 2 h no gelo.

2. centrifugar 20 min a 48,000 × g (4 °C). Transferir o sobrenadante que contém a proteína de fusão desnaturada para um tubo de centrifugação limpo.

3. adicionar Triton X-100 ao sobrenadante a uma concentração final de 1%.

4. Dialyze a amostra para PBS/glicerol durante 2-3 h. O volume do tampão de diálise deve ser, no mínimo, 20 vezes o volume da amostra.

5. marcar a amostra durante a noite versus a PBS com inibidores da protease utilizando um volume tampão > 100 vezes o volume da amostra.

6. retirar a amostra da diálise e centrifugar 20 minutos a 4000 × g.

7. a proteína extraída e recriada dos corpos de inclusão pode agora ser aplicada às colunas de glutationa Sefarose e purificada.

soluções:

tampão de Lavagem: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mm de PMSF, pH 8,0

U buffer: 5 M de uréia, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-ME, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM de PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS/glicerol: 1X PBS, 20% de glicerol, 1% Triton X-100, 5 mM 2-ME, com 5 mM de EDTA, 5 mM 2 – ME, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM de PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use de uma bomba peristáltica é aconselhável uniformemente o fluxo de controle taxas. Se ocorrer compressão da resina, a pressão é demasiado elevada e o caudal deve ser reduzido.

22a cinética de ligação entre glutationa e GST é relativamente lenta. Por conseguinte, é importante utilizar os caudais baixos para atingir a capacidade máxima de ligação, por exemplo, 0,1 ml/min para uma coluna de 2,5 cm. A utilização de caudais demasiado rápidos pode diminuir a quantidade de proteína de fusão ligada devido à cinética lenta da Associação. Os passos de lavagem e eluição podem ser realizados a caudais mais rápidos para poupar tempo (1, 5 ml/min e 0, 3 ml/min, respectivamente). Para amostras de grande volume, a ligação é mais convenientemente realizada durante a noite, com ajustes nos caudais de modo a que a coluna não fique seca.A análise das fracções não ligadas indicará se a proteína de fusão se liga ou não. Se a proteína não for detectada nas fracções iniciais, mas aparecer nas fracções posteriores, indica que a capacidade da coluna foi excedida. A redução da carga de proteínas ou o aumento do tamanho da coluna aliviarão esta condição.Se a proteína de fusão se liga mal à sefarose da glutationa, existem várias alternativas para tentar aumentar a eficiência de ligação. Tenta um método de lise mais suave. Se o método utilizado for demasiado duro, a proteína pode tornar-se desnaturada e, portanto, incapaz de se ligar à coluna. Além disso, se a proteína for re-naturada dos corpos de inclusão, certifique-se de que todos os desnaturantes foram removidos do tampão, quer através de diálise exaustiva, quer através da aplicação da amostra a uma coluna de dessalinização, antes de aplicar à coluna de glutationa. Retirar a solução de armazenagem de etanol da glutationa Sefarose; reduzir a coluna com tampão de glutationa fresco, seguida de uma lavagem com PBS imediatamente antes do Carregamento da amostra. Aumentar a quantidade de resina e/ou diminuir o caudal utilizado para carregar a amostra. Tente adicionar um TDT de 1 a 20 mM à amostra. Se um problema ainda persistir, limpe a coluna de acordo com a recomendação do fabricante. Se a ligação ainda não for restaurada, tente usar resina fresca.

25o Rendimento da proteína de fusão também pode ser estimado medindo a absorvância a 280 nm (A280). O coeficiente de extinção para a metade GST por si só é ~ 1,5, ou seja, 1,00 A280 = ~ 0.6 mg/ml de proteína, embora o coeficiente de extinção da proteína de fusão dependa parcialmente das características de absorvância da proteína-alvo.Se houver um problema para eluir a proteína da coluna de sefarose da glutationa, tente diminuir a taxa de fluxo e aumentar o volume de tampão de eluição que é usado. Certifique-se de utilizar tampão glutationa reduzido fresco (faça-o no dia em que será utilizado). Aumentar a concentração de glutationa para 40 mM e / ou elevar o pH do tampão para 8, 0–9, 0. Adicionar um TDT de 1-20 mM (ou outro agente redutor) ao tampão. A adição de um detergente não-iónico também pode melhorar a solubilização e minimizar qualquer agregação que possa estar a ocorrer.

27contaminação da proteína de fusão purificada com as proteínas das células hospedeiras de E. coli é uma indicação de que a sonicação foi demasiado grave. Se estiverem presentes fragmentos degradados da proteína de fusão, tente adicionar mais inibidores da protease ao tampão de lise. Manter todas as amostras, tampões e tubos de recolha frios para minimizar a proteólise. Se ocorrer degradação durante a expressão proteica, tente induzir a amostra tardiamente (~0.8 OD600) e diminuir o comprimento do período de indução. Mudar para uma estirpe alternativa do hospedeiro também pode ajudar.

28An alternative to in-solution digestion is protease clivage of fusion protein while bound to the glutathione Sepharose matrix. A proteína de fusão é extraída e carregada sobre a sefarose da glutationa, seguida de lavagem com PBS (ver purificação de afinidade da proteína de fusão GST, passos 1-11). Em vez de eluir a proteína com tampão de glutationa, uma solução PBS contendo a enzima é carregada na coluna e incubada durante várias horas à temperatura ambiente (4 °C para a protease de prescrição). A proteína clivada é então lavada da coluna com vários volumes de PBS. A proteína Residual de fusão e a fracção GST podem ser removidas da coluna lavando-a com um tampão de glutationa reduzido. A quantidade de enzima e o tempo de incubação devem ser determinados empiricamente para cada proteína de fusão. Analisar todas as amostras por SDS-PAGE para determinar a eficiência da clivagem e a pureza das proteínas.Numa clivagem da protease em modo descontínuo, adicionar uma quantidade empiricamente determinada de enzima à proteína de fusão ligada à resina (Ver nota 15 A–d). Utilizar 1 ml de enzima contendo PBS por ml de volume da cama. Incubar à temperatura ambiente durante várias horas com agitação suave. Centrifugar 500 × g durante 5 minutos para sedimentar a resina. Remover o super que contém a proteína alvo para um tubo separado. Lavar a sefarose da glutationa com PBS até 3 vezes para recuperar a proteína de fusão clivada. Incubar a resina com tampão de glutationa para remover GST e proteína residual de fusão. Utilizar 1 ml de tampão de glutationa por ml de resina. Centrifugar 500 × g e recuperar o GST eluído. Repetir até 3 vezes. Analisar amostras por SDS-PAGE.

30If utilizando trombina protease, a digestão pode ser efectuada no tampão glutationa utilizado para eluir a proteína a partir da coluna. Se utilizar factor Xa, recomenda-se a dialisação da proteína num tampão Tris ou num tampão PBS antes da digestão.; a glutationa presente no tampão de eluição pode perturbar as pontes de dissulfeto presentes no factor Xa, levando a uma digestão ineficiente da proteína de fusão. Deve ser determinada uma determinação empírica das condições de digestão para cada proteína de fusão num ensaio-piloto de digestão. Um método conveniente é digerir 100 µg de proteína de fusão numa gama de razões enzima-substrato e variar o tempo de incubação. Os tempos de incubação típicos variam entre 2 e 8 horas. 1:100, 1:350, 1:1000, e 1:3000 (unidades de enzima por µg de proteína de fusão) e para o factor Xa são 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µg enzimática por µg de proteína de fusão). Nos pontos de tempo desejados, remover 2 µg de proteína e interromper a digestão adicionando a alíquota da amostra ao tampão de amostras SDS em ebulição. Analise as amostras por SDS-PAGE para determinar as condições de clivagem ideais. Para além da razão enzima-substrato e do tempo, considere a alteração das condições do tampão, tais como o aumento ou diminuição da concentração de NaCl ou a adição de Ca2+ ao tampão (Ver nota 31 para dicas de solução de problemas).Se forem observadas na SDS-PAGE múltiplas faixas para a proteína alvo após a digestão, verifique a sequência de proteínas alvo para potenciais locais secundários de reconhecimento da protease. Se existem locais de clivagem secundários, re-clone em um vetor diferente. Se não for observada clivagem, verifique a sequência de ADN para verificar a presença e integridade do local esperado de clivagem da protease. Certifique-se de que os inibidores da protease foram completamente removidos do tampão. Adicionar mais enzima e / ou aumentar os tempos de incubação durante a noite. Se a digestão continua incompleto ao mais alto enzima ao substrato rácios e um tempo maior de pontos, considerar a reengenharia de protease clivagem site para incluir várias glycines entre o GST metade e a proteína alvo para diminuir a probabilidade de impedimentos estéricos interferindo com a clivagem (19, 20).Se for indesejável a inibição da enzima após a digestão utilizando inibidores da protease da serina, a amostra pode ser aplicada a uma coluna de benzamidina HiTrap para remover a enzima da amostra.

33 se a amostra for re-cromatografada na coluna de glutationa Sefarose para remover GST e qualquer proteína de fusão não digerida, é fundamental que a reduzida glutationa seja completamente removida da amostra. A glutationa equilibra-se muito lentamente através das membranas de diálise; assim, se for utilizada uma tubagem de diálise com um MWCO <12 000, podem ser necessárias 3 ou mais alterações de tampão para a remoção completa. Pode também ser necessário um aumento do tempo de diálise (overnight) e um maior volume de tampão para grandes volumes de amostras.

34 a mesma coluna de glutationa Sefarose pode ser utilizada tanto para o isolamento inicial da proteína de fusão como para a repurificação após clivagem enzimática. Recomenda-se dedicar uma única coluna a uma construção proteica individual para evitar a potencial contaminação cruzada de diferentes proteínas recombinantes. As colunas podem ser reutilizadas várias vezes. Se a eficiência de ligação diminuir ao longo do tempo, limpe a coluna de acordo com as recomendações do fabricante. Se a actividade de ligação não for restaurada, deve utilizar-se uma nova coluna.

35A ligação máxima ocorre se a coluna estiver completamente reduzida; no entanto, se a coluna de glutationa Sefarose foi lavada menos de 48 h antes deste passo, este passo pode ser ignorado.

36A proteína – alvo será na fracção não ligada e o GST e qualquer proteína de fusão não clivada ligar-se-á à coluna.

37 volumes mínimos de amostras são recomendados para uma boa resolução da proteína alvo em relação a outros contaminantes. Se não for possível concentrar a amostra num pequeno volume, podem ser realizadas múltiplas injecções da amostra.