PMC

CPV-2 é o principal agente etiológico da gastroenterite viral em cães. É membro da família Parvoviridae, pertencente ao gênero theProtoparvovirus e espécie Protoparvovirus tipo 1. Ele não é um vírus envelopado com um single stranded DNA do genoma, whichencodes para duas proteínas da cápside, VP1 e VP2, necessários para a montagem e embalagem do genoma viral, bem como para o NS1 e NS2 procede proteínas, whichaid no controle da replicação do DNA, a montagem e a regulação dos genes de expressão .Nos últimos anos, a CPV-2 desenvolveu novas variantes antigênicas. Em 1980, a estirpe original CPV-2 foi substituída pela variante designada tipo 2a (CPV-2a), em 1984,a CPV-2b foi identificada e , em 2001, a CPV-2c foi detectada e notificada em Itália. A última variante foi também identificada na Ásia, África e América. Devido à existência de múltiplas variantes antigênicas para CPV-2, os sinais clínicos podem variar muito .Posteriormente, os veterinários têm menos certezas ao emitirem o seu diagnóstico presuntivo e, normalmente, são necessários alguns testes laboratoriais para confirmar o seu diagnóstico.; embora várias técnicas têm sido desenvolvidas em laboratórios de pesquisa, tais como ensaios de hemaglutinação, de imunofluorescência, ELISA, PCR,immunochromatography de teste e de cultura de células (entre outros), na verdade, as técnicas com maior disponibilidade dentro de laboratórios clínicos veterinários hospitalsonly são os immunochromatography teste e PCR, no entanto, na pesquisa sobre a sensibilidade e especificidade destes procedimentos, os relatórios são controversos.Além disso, em doentes com diferentes graus de gravidade da doença, a sensibilidade e especificidade destas técnicas não foram extensivamente estudadas.

o objectivo deste estudo é relatar as vantagens e desvantagens oferecidas pelo teste de imunocromatografia e PCR para o diagnóstico de doentes que apresentam uma grande diversidade de sinais clínicos para CPV-2.

este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes da Experimental Animal Research Norma Oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999.

cães com enterite clínica hospitalizados no Hospital Veterinário para pequenos animais da Universidad Autónoma de Estado de México, foram examinados para este estudo e seleccionados com base em CPV-2 positivo ou negativo, utilizando PCR aninhado (nPCR). Como resultado, 45 cães que deram positivo foram selecionados, e 5 cães negativamentetested foram incluídos como controles. Os 50 cães foram examinados clinicamente por três veterinários simultaneamente para obter a sensibilidade do diagnóstico clínico. Eachveterinarian issued his presumptive diagnosis in a discrete manner, using the problem oriented veterinary medical record (POVMR) as their diagnostic tool.

em seguida, amostras fecais de todos os cães foram analisadas através de PCR e teste de imunocromatografia, enquanto amostras de sangue foram usadas para realizar um hemograma completo.

nPCR é considerada uma técnica altamente confiável e sensível para identificar partículas virais de CPV-2 , e portanto, neste estudo, a sensibilidade dos testes usados foi correlacionada com os obtidos anteriormente a partir de nPCR, para diagnóstico de CPV-2.

as amostras de fezes do cão foram obtidas utilizando esfregaços rectais, que foram suspensos em água sem nucleases e 200 µl dos homogeneizados, e foram utilizados para extracção com ADN. O procedimento foi realizado utilizando o kit de extracção de ADN das fezes QIAamp® (QIAGEN, Mainz, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. AllDNA samples were quantified using a Q5000 Quawell spectrophotometer (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, U. S. A.). Foram utilizados 100 ng de ADN de cada amostra para reacções PCR com 50 µl de volume final. Anteriormente, um par de primers foi desenvolvido em nosso laboratório para amplificar um 275 bp fragmento,ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) e ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTTAATGCAGTTA-3′), localizado na nucleotídeos 1,107–1,130 e 1,360–1,382 do gene VP2 (GenBankaccession número FJ0051962c).

reações de PCR foram realizadas utilizando-se 2 µl de cada primer (200 nM), de 12,5 µl de GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, WI,U. S. A.) contendo DNA polimerase, Tampão de reação (pH 8.5) e 400 µM de cada um dos nucleotídeos (dATP, dGTP, Dctp e dTTP); 3 mM de MgCl2.e 28.5 µl de água livre de nucleases. Todas as reacções foram realizadas nas seguintes condições de amplificação: 1 ciclo a 94 ° C durante 5 minutos para a desnaturação inicial, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto e um ciclo de extensão final a 72°C durante 5 minutos.

nPCR foi feito inicialmente para amplificar um fragmento de 1,740 bp usando ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) e ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC-3′), primers,e foram projetados usando as sequências nucleotídicas 1-20 e 1,712–1,740 do gene VP2 para o parvovírus canino (GenBank número de entrada FJ0051962c). A reacção foi padronizada para um volume final de 50 µl.

A mistura de reacção continham 1 µl de GoTaq® Flexi DNA Polimerase 5 U/µl (Promega), 5 µl de GoTaq® Flexi buffer 5XGreen, 3 µl de MgCl2 25 mM, 4 µl de mistura de dntp 200 µM, 2 µl de primers, 10 µl de DNA com uma concentração final de 100 ng e 23 µl de água livre de nuclease. A reacção foi realizada nas seguintes condições de amplificação: 1 ciclo a 94 ° C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 45 segundos, 72°C durante 1 minuto e 1 ciclo a 72°C durante 5 minutos. Em seguida, 1 µl do produto desta reação foi usado como um modelo de DNA para o procedimento de nidificação, e os iniciadores e as condições de amostragem foram os mesmos para 275 fragmentos de bp.

todos os produtos de amplificação foram identificados através da electroforese horizontal em géis de agarose a 2% manchados com 0,5 µg/ml de brometo de etídio e visualizados com um transiluminador UV.

para a análise do teste de imunocromatografia para o parvovírus canino( CPV Ag), O kit ANIGEN® (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Coreia) foi utilizado. Cada ensaio foi efectuado de acordo com as instruções do fabricante.

foram colhidas amostras de sangue da veia jugular utilizando tubos vacutainer com EDTA como anticoagulante. Foram realizadas contagens completas de células sanguíneas (CBC) utilizando um contador de células automatizadas (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, U. S. A.). Os filmes de sangue foram manchados com Wright-Giemsa e examinados sob um fotonicmicroscópio. A leucopenia foi considerada quando o número total de CBC foi inferior a 6 × 103/µl .

a análise dos Resultados foi realizada através da utilização de uma matriz para variáveis codificadas , e foram criadas tabelas de contingência para determinar as propriedades de teste de diagnóstico . Além disso, a estatística Kappa foi determinada a estimar o Acordo entre os três testes usados, e nPCR. O valor kappa foi caracterizado de acordo com Kantere e colegas em 2015, onde o valor 1 indica acordo absoluto, enquanto um valor de 0 indica que o acordo ocorre devido ao acaso. Em geral, os valores Kappa superiores a 0.6 indicam um bom nível de concordância; a análise foi realizada utilizando o pacote estatístico SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc.), Armonk, NY, U. S. A.).

noventa e um por cento (91,1) dos cães positivos para CPV-2 pela nPCR eram de raça pura; 95.5% dos pacientes tinham entre dois e oito meses de idade, e 4, 5% eram mais velhos do que um ano. No que se refere ao seu estatuto de vacinação, 40% foram vacinados pelo menos uma vez para prevenir a infecção por CPV-2.

Frequência de sinais clínicos, mostrou, por esses cães, foi como segue: 44.4% apresentado vômitos e diarréia; 20% teve febre, vômitos e diarréia(catarrhal ou hemorrágica); 17.7% apresentaram apenas diarréia; 8.8% apresentado apenas o vómito; e 4,4% tiveram diarréia e febre, e 4,4% apresentaram vômitos e febre.Observou-se leucopenia em 48, 8% dos cães (Tabela 1).

Usando-se o exame clínico, os médicos veterinários diagnosticada apenas 57.8% dos pacientes positivos para CPV-2, e 100% dos negativos cães; portanto, o valor de sensibilidade forclinical diagnóstico foi estimado como a 57,7% (CI0.95 42.2–72), e observada a especificidade foi de 100% (CI0.95 46.2–98.8).

no que diz respeito ao diagnóstico de testes laboratoriais, de 100% dos cães que resultaram positivos através da nPCR, apenas 30/45 destes doentes foram testes de cromunocromatografia com CPV-2 positivos, enquanto os cinco doentes de controlo que apresentaram resultados negativos para a CPV-2 foram correctamente diagnosticados. Por conseguinte, esta técnica demonstrou uma sensibilidade de 66, 6% (CI0.95 50, 9–79, 5), e a especificidade observada foi de 100% (CI0.95 46, 2–98, 8).

utilizando a técnica de PCR, 36 / 45 doentes foram positivos para CPV-2, e os cinco doentes de controlo foram confirmados negativos ao longo da nPCR. Assim, a PCR demonstrou uma sensibilidade de 80% (CI0.95 63.1–87.7) e uma especificidade de 100% (CI0.95 67.8–99. 1) (Fig. 1).

a concordância entre as três técnicas é demonstrada através do valor Kappa (Tabela 2).

a Gastroenterite causada por CPV-2 é considerada uma das principais doenças virais que afetam os cães. Embora os sinais clínicos de infecção por parvovírus canino possam variar, os sinais mais comuns relatados foram: anorexia, depressão, letargia ,febre, diarreia e leucopenia mucosas e hemorrágicas ; em casos subclínicos, alguns destes sinais podem ou não estar presentes .Durante o exame clínico foi observada variabilidade nas manifestações clínicas da infecção. Apenas 20% dos cães estudados apresentavam sinais típicos como descritos na literatura. A variabilidade clínica para esta doença foi relatada anteriormente, e alguns autores discutiram factores, tais como a idade, o estado imunitário, a via de exposição, a dose viral, a virulência das estirpes e a co-infecção com outros agentes infecciosos como possíveis causas . Isto complica a obtenção de um diagnóstico preciso do CPV-2 quando os veterinários dependem apenas do seu exame clínico. Portanto, em relação à nossa investigação apenas com base neste procedimento, 42,2% dos cães terão um diagnóstico falso-negativo CPV-2.Através dos registos médicos dos cães neste estudo, observámos que os veterinários estavam a excluir a possibilidade de infecção, principalmente porque os cães não exibiam os sinais clínicos clássicos descritos na literatura, tinham sido vacinados contra o CPV-2 e/ou eram adultos. No entanto, a maioria dos cães em nosso estudo apresentaram sinais atípicos. Por conseguinte, acreditamos que as infeções subclínicas do CPV-2 são mais comuns, e os veterinários, que devem decidir se devem ou não utilizar testes de diagnóstico adicionais com elevada sensibilidade e especificidade, devem considerar cuidadosamente estes achados.Neste estudo, 40% dos doentes positivos para CVP-2 tinham sido previamente imunizados. É bem conhecido que a técnica de PCR é altamente sensível e, portanto, detecta partículas virais desvaccina em fezes de doentes recentemente vacinados; estudos indicam que é possível obter resultados falsos-positivos dos dias 3 a 10post-vacinação com uma vacina viva de CPV modificada . Consequentemente, para realizar este estudo, foram excluídos doentes com história de vacinação nos 15 dias anteriores. Adicionalmente, foram sequenciadas amostras de cães vacinados positivos para CPV-2 e, em todos os casos estudados, foi identificado o genovariante CPV-2c (os dados não mostram), o que implica que os cães foram infectados com o campo CPV-2c, sabendo que ainda não está disponível CPV-2cvaccina no México. Além disso, no México, Pedroza e colegas relataram que a variante antigênica mais comum em cães infectados foi CPV-2c .

por outro lado, muitos veterinários consideram a presença de leucopenia, um factor de suporte para o diagnóstico de CPV-2. No entanto, observamos que apenas 48.8% (22/45) dos cães estudados apresentaram leucopenia durante a avaliação, o que é consistente com outros relatórios que indicou que cerca de 50% dos cães não apresentar hematologicalterations no momento da avaliação . Portanto, um CBC é uma ferramenta valiosa que pode fornecer informações sobre a severidade da doença, sugerindo um prognóstico e determinando a resposta ao tratamento. No entanto, a leucopenia não deve ser considerada como um instrumento de diagnóstico para CPV-2,uma vez que não fornece uma evidência para a presença de vírus.

várias técnicas de identificação viral são utilizadas para a confirmação definitiva da infecção pelo CPV-2, por exemplo, testes rápidos baseados na imunocromatografia são amplamente utilizados pelos médicos, porque o procedimento é fácil, rápido e acessível. Além disso, não requer preparação de amostras ou envio para um laboratório especializado para análise. A sensibilidade variável deste teste é a sua desvantagem; vários estudos indicaram que a sua sensibilidade varia de 50 a 100% , e no nosso estudo, a sensibilidade comparativa com nPCR foi de 66,6%. Alguns estudos sugeriram que a baixa sensibilidade técnica é devida à necessidade de uma grande quantidade de partículas virais a ser derramado nas fezes dos cães para obter um diagnóstico positivo . A utilização desta técnica deve ser reconsiderada, uma vez que se espera uma maior probabilidade de resultados falsos negativos. Para evitar isso, devem ser utilizadas novas técnicas, com maior sensibilidade .

vários estudos demonstraram a elevada sensibilidade dos testes baseados na PCR; Actualmente, existem múltiplas variantes do mesmo procedimento que oferecem sensibilidades entre 80% e 100%. No presente estudo, a PCR teve uma sensibilidade de 80%, e vale ressaltar que os pacientes só foram identificados como positivos à infecção através da nPCR entretanto nem a PCR nem os testes de imunocromatografia foram capazes de identificá-la.

em relação ao valor kappa, comparamos os resultados entre os três métodos analisados ao nPCR. O fraco acordo entre o diagnóstico clínico e a NPCR foi, no entanto, demonstrado; foi observado um acordo moderado entre a PCR convencional e a nPCR, o que pode ser devido à semelhança entre os dois testes.

a Respeito de sinais clínicos, a presença de vômitos ou diarréia foi observada em todas as viral em pacientes infectados, enquanto outros sinais clínicos foram notconsidered relevantes para a infecção; de acordo com os sinais clínicos e a sensibilidade das técnicas usadas, nenhuma relação foi observada. Por exemplo, o caso n. º 26 mostrou apenas vómitos como um sinal clínico, e foi considerado negativo para CPV-2 pelo diagnóstico clínico veterinário, no entanto, o teste de imunocromatografia, PCR e nPCRtests foram positivos para CPV-2. Além disso, os casos 41 e 42 em que o principal sinal clínico foi diarreia, só poderia ser diagnosticado positivo para CPV-2 usando nPCR.

os nossos dados indicam que os testes de diagnóstico mais frequentemente utilizados em laboratórios clínicos e veterinários de diagnóstico para detectar CPV-2 são altamente específicos, mas a sensibilidade à lacagem, o que impede o diagnóstico preciso da CPV-2. No nosso estudo, a PCR e o teste de imunocromatografia não foram tão sensíveis como a nPCR, o que foi confirmado em investigações anteriores , no entanto, a utilização da nPCR como teste de diagnóstico ainda não é amplamente difundida nos hospitais veterinários,embora continue a ser amplamente utilizada para fins de investigação.Por outro lado, a PCR em tempo Real, que também é altamente sensível, raramente é utilizada, devido aos seus elevados custos de equipamento e à necessidade de pessoal altamente especializado para o seu manuseamento. No entanto, os avanços tecnológicos permitiram que estas técnicas se tornassem mais baratas e mais simples de usar, o que poderia levar à sua aplicação direta em hospitais veterinários para melhorar a precisão de diagnóstico para CPV-2.