> Proteína purificationEdit
Polyhistidine-tags são muitas vezes utilizados para a afinidade de purificação de polyhistidine marcados de proteínas recombinantes expressas em Escherichia coli e outros procariontes sistemas de expressão. As células bacterianas são colhidas por centrifugação e o sedimento celular resultante é lisado quer por meios físicos quer por detergentes e enzimas como a lisozima ou qualquer combinação destas. Nesta fase, o lisato bruto contém a proteína recombinante entre muitas outras proteínas provenientes do hospedeiro bacteriano. Esta mistura é incubada com uma resina de afinidade contendo iões de níquel divalente ligado ou de cobalto, que estão disponíveis comercialmente em diferentes variedades. Níquel e cobalto têm propriedades similares e como são metais de transição período adjacente 4 (v. tríade de ferro). Estas resinas são geralmente sepharose/agarose acrescida com um quelante, como iminodiacetic ácido (Ni-AID) e nitrilotriacetic ácido (Ni-NTA) para o níquel e carboxilo-metil-aspartato (Co-CMA) para o cobalt, que a polyhistidine-tag liga com micromolar de afinidade. Ernst Hochuli et al. em 1987, associaram o ligante N. T. e os níquel-iões às contas de agarose. A resina é então lavada com tampão fosfato para remover proteínas que não interagem especificamente com o ião cobalto ou níquel. Com métodos baseados em Ni, a eficiência de lavagem pode ser melhorada pela adição de imidazol de 20 mM (as proteínas são normalmente eluídas com 150-300 mM de imidazol). Geralmente, as resinas à base de níquel têm uma maior capacidade de ligação, enquanto as resinas à base de cobalto oferecem a maior pureza. A pureza e a quantidade de proteína podem ser avaliadas pela SDS-PAGE e Western blotting.A purificação da afinidade por meio de uma etiqueta de poli-histidina resulta normalmente numa proteína relativamente pura quando a proteína recombinante é expressa em organismos procarióticos. Dependendo das aplicações a jusante, incluindo a purificação de complexos proteicos para estudar interações proteicas, a purificação de organismos superiores, como leveduras ou outros eucariotas, pode exigir uma purificação de afinidade tandem usando duas tags para produzir maior pureza. Em alternativa, a purificação de um único passo utilizando iões de cobalto imobilizados em vez de iões de níquel produz geralmente um aumento substancial na pureza e requer concentrações de imidazol mais baixas para a eluição da proteína marcada por ele.
a marcação com poli-histidina é a opção de escolha para a purificação de proteínas recombinantes em condições de desnaturação porque o seu modo de Acção depende apenas da estrutura primária das proteínas. Por exemplo, mesmo quando uma proteína recombinante expressa à força em E. coli produz um organismo de inclusão e não pode ser obtido como uma proteína solúvel, pode ser purificado com desnaturação com ureia ou cloridrato de guanidina. Geralmente, para este tipo de técnica, a ligação com histidina é titulada usando pH em vez de ligação com imidazol—a um pH elevado, a histidina liga-se ao níquel ou cobalto, mas a um pH baixo (~6 para o cobalto e ~4 para o níquel), a histidina torna-se protonada e é competida do íon metálico. Compare isto com a purificação de anticorpos e a purificação do GST, um pré-requisito para o qual é a dobragem adequada (nativa) de proteínas envolvidas. Por outro lado, diz-se que a sua tag tende a agregar e insolubilizar mais do que outras tags de afinidade.
as colunas da etiqueta-poli-histidina retêm várias proteínas bem conhecidas como impurezas. Um deles é a isomerase de peptidil prolil, tipo fkbp, que aparece em torno de 25kDa (SlyD). As impurezas são geralmente eliminadas utilizando uma técnica cromatográfica secundária, ou expressando a proteína recombinante numa estirpe E. coli com deficiência de SlyD. Alternativamente, comparando com resinas à base de níquel, cobalto têm menor afinidade com SlyD de E. coli, mas em vários casos, é moderadamente útil.
proteínas com diferentes números de etiquetas de poliistidina eluem diferentemente da resina de afinidade com níquel. Para as proteínas com uma única etiqueta de Hexa-histidina, o imidazol de 75 mM permite a eluição a partir do Ni-neta, enquanto para as proteínas com duas etiquetas de Hexa-histidina é necessário 100 mM de imidazol para a eluição. Esta eluição passo-a-passo pode ser utilizada para isolar conjuntos proteicos específicos de uma mistura, tais como heteromultímeros definidos (por exemplo, um heterodímero AB de uma mistura incluindo homodímeros AA e BB, se apenas a subunidade B tiver uma etiqueta de poliistidina). Tal abordagem foi utilizada isoladamente da estreptavidina monovalente.
ligação assaysEdit
a marcação com Poliestidina pode ser utilizada para detectar interacções proteínas-proteínas da mesma forma que um ensaio de retirada. No entanto, esta técnica é geralmente considerada menos sensível, e também restringida por alguns dos aspectos mais delicados desta técnica. Por exemplo, as condições de redução não podem ser utilizadas, O EDTA e muitos tipos de detergentes não podem ser utilizados. Os recentes avanços na interferometria de polarização dupla são favoráveis ao EDTA e a um uso mais amplo de reagentes, e o uso de tais tags específicos do local simplifica grandemente a medição direta da mudança conformacional associada.Foram também desenvolvidas etiquetas de CyDye fluorescentes com
Hexahistadina. Estes utilizam coordenação covalente de níquel para grupos EDTA ligados a fluoróforos, a fim de criar corantes que se ligam à etiqueta de poliistidina. Esta técnica demonstrou ser eficaz para acompanhar a migração e o tráfico de proteínas. Também houve descobertas recentes que mostram que esta técnica pode ser eficaz a fim de medir a distância através da transferência de energia de ressonância fluorescente.
foi notificada uma marca de polifluorohistidina para utilização em sistemas de Tradução in vitro. Neste sistema, um código genético expandido é usado no qual histidina é substituída por 4-fluorohistidina. O análogo fluorado é incorporado em peptídeos através da especificidade de substrato relaxado da ligase histidina-tRNA e reduz a pKa global da tag. Isto permite o enriquecimento selectivo dos péptidos etiquetados com polifluorohistidina na presença de misturas complexas de marcas tradicionais de poliistidina, alterando o pH dos tampões de lavagem.
