acest post a fost contribuit de Kurt Thorn de la Nikon Imaging Center de la UCSF.
o cerință comună pentru experimentele de imagistică cu celule vii este capacitatea de a urmări simultan mai multe specii etichetate fluorescent. Pentru a face acest lucru cu etichetele de proteine fluorescente necesită mai multe proteine fluorescente ale căror spectre de excitație și emisie diferă suficient pentru ca acestea să fie imaginate în canale fluorescente distincte la microscop. Odată cu proliferarea proteinelor fluorescente în ultimii ani, există multe combinații de proteine fluorescente care pot fi imaginate împreună, dar acest lucru înseamnă, de asemenea, că alegerea proteinelor fluorescente necesită o anumită gândire.
primul pas în alegerea proteinelor fluorescente pentru experimentul dvs. de imagistică multicoloră este să fiți conștienți de ce proteine fluorescente sunt disponibile. Cu noi proteine fluorescente publicate în fiecare lună, decizia cu privire la cea mai bună proteină pentru o anumită aplicație este o provocare. Pentru a vă ajuta să vă țineți la curent cu cele mai recente proteine fluorescente, mențin un grafic interactiv și un tabel cu cele mai bune proteine fluorescente disponibile în prezent.
alegerea proteinelor fluorescente compatibile
pentru a alege un set de proteine fluorescente care să fie imaginate împreună, va trebui să luați în considerare aceiași factori ca atunci când alegeți o proteină fluorescentă individuală (luminozitate, fotostabilitate și așa mai departe; consultați postarea anterioară pe blog pentru mai multe discuții despre acești factori). În plus, va trebui, de asemenea, să alegeți proteine fluorescente care pot fi distinse una de cealaltă și care pot fi imaginate cu optica de pe microscopul(ele) pe care intenționați să îl utilizați. O determinare exactă a faptului dacă două proteine fluorescente pot fi separate una de cealaltă necesită cunoașterea spectrelor lor de excitație și emisie, dar o regulă bună este că atât lungimile de undă de excitație de vârf, cât și lungimea de undă de emisie de vârf a celor două proteine ar trebui separate cu 50-60 nm. De exemplu, PCP (ex 430 nm / em 474 nm) și YFP (ex 514 nm / em 527 nm) pot fi imaginate împreună, dar PCP și GFP (ex 488 nm / em 507 nm) prezintă unele diferențe între cele două proteine fluorescente. Dacă trebuie să imaginați proteine fluorescente ale căror Spectre se suprapun, există tehnici, cum ar fi unmixarea spectrală, care pot fi utilizate pentru a separa proteinele fluorescente, dar acestea depășesc domeniul de aplicare al acestui post.
proteinele fluorescente sunt compatibile cu optica microscopului?
pentru a determina dacă proteinele fluorescente care vă interesează sunt compatibile cu optica microscopului dvs., veți dori să comparați spectrele de excitație și emisie ale proteinei dvs. cu seturile de filtre sau laserele de pe microscop. În mod ideal, doriți să aveți o suprapunere substanțială între filtrele de excitație și emisie și spectrele de excitație și emisie ale proteinei, astfel încât proteina să fie bine excitată de microscop și emisia de fluorescență a proteinei să fie colectată eficient de microscop. Pentru a compara potrivirea dintre o proteină fluorescentă și un set de filtre, mulți furnizori de seturi de filtre oferă instrumente pentru a trasa spectrele de fluorescență ale proteinelor și coloranților și filtrele lor (vezi Chroma, Semrock sau Omega). Deși acestea nu conțin toate proteinele fluorescente de uz comun (în special cele publicate cel mai recent), ele pot fi un bun punct de plecare. În multe cazuri, este suficient să utilizați un spectru pentru o proteină strâns legată, dacă știți că proteina dvs. de interes are un spectru similar. De exemplu, iată o captură de ecran de la Chroma Spectra Viewer comparând un set standard de filtre Cy3 sau Rodamină (Chroma #49004) cu spectrele atât ale mCherry, cât și ale TagRFP.
aici, spectrul TagRFP este prezentat în culorile mai întunecate, iar spectrul mCherry este prezentat în culorile mai deschise; spectrele de excitație sunt albastre, iar spectrele de emisie sunt roșii. Nici nu se potrivește perfect cu setul de filtre, dar filtrul de excitație excită mai mult din vârful excitației TagRFP, iar filtrul de emisie colectează o fracțiune mai mare din emisia TagRFP decât emisia mCherry. Pentru acest set de filtre, ne-am aștepta ca TagRFP să dea un semnal mai luminos decât mCherry. În general, seturile de filtre concepute pentru Rodamină / Cy3 vor funcționa mai bine cu proteine fluorescente roșii cu lungime de undă mai scurtă, cum ar fi TagRFP sau mRuby2, decât proteinele cu lungime de undă mai lungă, cum ar fi mCherry. Pentru fundal privind seturile de fluorescență și filtre, a se vedea prelegerea Introducere în microscopia fluorescentă la ibiologie.
seturi de filtre utilizate în mod obișnuit & proteine fluorescente relevante
seturile de filtre utilizate în mod obișnuit pentru imagistica multicoloră includ cele concepute pentru PCP, YFP și RFP sau setul de filtre Sedat Quad, conceput pentru Dapi / fluoresceină / Rodamină / Cy5 (de exemplu, Semrock) și combinația similară cu 4 laser pe un 405 / 488 / 561 / 640 nm). În mâinile noastre, cele mai bune proteine fluorescente pentru imagistica cu acest set sunt mTagBFP2, EGFP sau una dintre variantele GFP îmbunătățite, mRuby2 sau TagRFP-T și o proteină fluorescentă în infraroșu, cum ar fi iFP1.4 sau iFP2.0. Feriți-vă că aceste proteine fluorescente în infraroșu necesită biliverdin ca cofactor și, prin urmare, poate fi necesar să vă suplimentați celulele cu biliverdin pentru o luminozitate maximă. În celulele de mamifere, una dintre variantele de pliere îmbunătățite ale EGFP, cum ar fi mEmerald sau trifoi, este probabil cea mai bună; mNeonGreen este o proteină fluorescentă verde și mai nouă, care se presupune a fi extrem de strălucitoare. În S. cerevisiae, am testat o serie de proteine fluorescente verzi și roșii cu acest set de filtre și am raportat măsurători de luminozitate. Aici, EGFP depășește variantele de pliere îmbunătățite, probabil datorită temperaturii de creștere mai scăzute. Acest lucru sugerează, totuși, că nu există o singură proteină fluorescentă optimă pentru toate organismele și că, dacă doriți cel mai strălucitor semnal, poate fi necesar să încercați mai multe proteine din sistemul dvs. de interes. În cele din urmă, în acest set de proteine proteinele verzi și roșii sunt, în general, cele mai detectabile și deci ar trebui folosite pentru a eticheta proteinele cele mai puțin abundente, cu canalele albastre și infraroșii utilizate pentru proteine mai abundente sau compartimente de marcare.
sper că acest lucru aruncă o lumină asupra imaginii multicolore cu proteine fluorescente. Cu microscopul potrivit și alegerea corectă a proteinelor fluorescente, imagistica a patru culori simultan ar trebui să fie destul de simplă.
mulțumim bloggerului nostru invitat!
Kurt Thorn este profesor asociat la UCSF, unde conduce Centrul de imagistică Nikon. Și-a luat doctoratul în biofizică de la UCSF în laboratorul lui Ronald Vale, după care a fost coleg la Centrul Bauer pentru cercetări genomice de la Universitatea Harvard. Aflați mai multe pe pagina sa web de laborator sau pe blogul său de microscopie.
