comparație între decalcifierea convențională și o metodă asistată de microunde în țesutul osos afectat de micetom

rezumat

Micetomul este o boală granulomatoasă pe tot parcursul vieții a țesuturilor și oaselor subcutanate. Histopatologia este o metodă indicativă fundamentată bazată pe presupunerea unui diagnostic definitiv al micetomului. Aceasta necesită o prelucrare eficientă a țesuturilor, inclusiv decalcifierea osoasă. Procesul de decalcifiere trebuie să asigure îndepărtarea completă a calciului și, de asemenea, o conservare adecvată a capacității de colorare a țesuturilor și microorganismelor. Obiective. Pentru a compara metoda convențională utilizată în decalcifiere cu metoda cu microunde folosind diferite soluții de decalcifiere. Au fost testate diferite caracteristici, inclusiv viteza de decalcifiere și conservarea morfologică și fungică în țesutul osos afectat de micetom. Materiale și metode. Au fost utilizate trei soluții de decalcifiere pentru îndepărtarea calciului din 50 de probe de țesut osos afectate de micetom, incluzând 10% EDTA tamponat neutru (pH 7,4), 5% acid azotic și 5% acid clorhidric. Au fost utilizate metode convenționale și cu microunde. Pata de hematoxilină-eozină (HE), pata lui Gridley și pata Grocott hexamină-argint au fost folosite pentru a evalua morfologiile osoase și fungice. Rezultate. Timpul de decalcifiere al metodei convenționale comparativ cu metoda cu microunde cu 10% EDTA (pH 7,4) a durat 120 de ore și 29 de ore, în timp ce 5% acid clorhidric și 5% acid azotic au durat 8 ore și 3 ore, separat. De asemenea, 10% EDTA este cel mai bun agent de decalcifiere pentru colorarea și petele fungice. 5% acid clorhidric și 5% acid azotic pot fi utilizate pentru colorarea fungică. Concluzie. Studiul actual a investigat efectele diferiților agenți de decalcifiere, precum și două proceduri de decalcifiere asupra conservării structurii osoase și a colorării fungice, care vor ajuta la elaborarea unor protocoale adecvate pentru analizele țesutului osos afectat de infecția cu micetom.

1. Introducere

Micetomul este o boală epidemică granulomatoasă pe tot parcursul vieții, treptat dăunătoare a pielii și a țesuturilor subcutanate, care poate progresa către structuri mai profunde, cum ar fi mușchii și oasele și poate duce la distrugerea extensivă, în principal a picioarelor, necesitând excizii chirurgicale locale largi sau amputarea membrelor . Micetomul este definit de triumviratul expansiunii, sinusurile epuizante și existența boabelor coloniale în exudatele inflamatorii . Infecția este clasificată ca eumicetom (infecție fungică) sau actinomicetom (infecție bacteriană) . Este în general o condiție a regiunilor tropicale și semitropicale, vizibil Sudan . Boabele de cultură Madurella mycetomatis sunt uriașe, variind de la 0,5 la 3 mm și apar rotunjite, ovale sau trilobate. Acestea constau din hife încrucișate înrădăcinate în ciment maroniu interstițial, constând din pigment de tip melanină, negru-maroniu . Histopatologia este o metodă indicativă rapidă, precum și un proces avantajos pe ipoteza unui diagnostic definitiv al bolii micetomului și include un raport care descrie prezentarea morfologică a agenților cauzali. Agentul cauzal ar putea fi încă izolat de țesutul osos implicat . Decalcificarea este un pas fundamental care se realizează în mod obișnuit pentru examinarea histopatologică a oaselor . Mineralele din oase constau din calciu și fosfor, iar sărurile insolubile cuprind mai mult de șaizeci la sută din țesutul osos . Aceste minerale oferă duritate osoasă și sunt cauza dificultăților în timpul tăierii țesuturilor folosind microtomi rotativi . Astfel de țesuturi trebuie tratate pentru a extrage fosfatul de calciu printr-o procedură cunoscută sub numele de decalcifiere, făcând țesutul suficient de delicat pentru a fi tăiat de Microtom. Decalcificarea se realizează prin acizi care formează săruri de calciu solubile sau agenți de chelare care se leagă de ionii de calciu. Metodele convenționale actuale de decalcifiere se caracterizează prin procese laborioase și eșecul persistent al reacției de colorare a țesuturilor . În metoda convențională de decalcifiere, țesuturile osoase sunt plasate într-un fluid de decalcifiere la temperatura camerei, cu modificări ale soluției la intervale regulate până la atingerea punctului final. Decalcificarea cu microunde este o tehnică inovatoare în comparație cu metoda convențională . În acest proces, țesuturile solide sunt plasate în soluția de decalcifiere într-un cuptor cu microunde pentru durate periodice cu schimbări obișnuite ale fluidelor de decalcifiere până la atingerea punctului final. Radiația cu microunde a fost efectuată pentru a accelera procedura de decalcifiere aproximativ de la zile la ore . Scopul studiului de față a fost de a compara metoda convențională utilizată în decalcifiere cu metoda modificată cu microunde folosind diferite soluții de decalcifiere. Au fost testate diferite caracteristici, inclusiv viteza de decalcifiere și conservarea morfologică și fungică a țesutului osos afectat de infecția cu Madurella mycetomatis.

2. Materiale și metode

acesta este un studiu experimental descriptiv menit să compare procedura convențională de decalcifiere cu decalcificarea îmbunătățită cu microunde în ceea ce privește morfologia țesuturilor afectate de infecția cu micetom folosind pete de hematoxilină și eozină, Gridley și Grocott hexamină-argint pentru identificarea completă a organismelor cauzale Madurella mycetomatis. Acest studiu a fost realizat la Centrul de cercetare Mycetoma din Spitalul Universitar Soba și la Facultatea de științe Medicale de laborator, Universitatea din Al Neelain. Consimțământul scris informat a fost obținut de la toți pacienții. Au fost colectate cincizeci de membre amputate afectate de micetom. Biopsiile osoase au fost tăiate folosind un ferăstrău adecvat în bucăți de 5 mm grosime și apoi fixate în soluție salină formală de 10% timp de 48 de ore. Au fost spălate sub apă curentă de la robinet timp de 30 de minute pentru a îndepărta fixativul.

2.1. Procedura convențională de decalcifiere

trei bucăți de secțiuni de 5 mm grosime de biopsii osoase au fost scufundate în trei pahare de 250 ml Pyrex Squat conținând fiecare 100 ml de acid clorhidric apos 5% (HCl), acid azotic apos 5% (HNO3) și acid etilendiaminotetraacetic 10% (EDTA) plasate la temperatura camerei (în medie 28 C), A se vedea tabelul 1. Punctul final al decalcificării a fost verificat folosind metoda oxalatului de calciu pentru cei doi decalcifianți acizi (5% HNO3 și 5% HCl) după un interval de două ore, după cum urmează: 5 ml din lichidul de decalcifiere utilizat au fost luați și plasați într-o eprubetă, apoi s-a adăugat hârtie de turnesol și s-a adăugat hidroxid de amoniac picătură cu picătură până când hârtia de turnesol s-a schimbat, indicând că lichidul de decalcifiere a pH-ului alcalin a fost limpede. S-au adăugat 5 ml soluție saturată de oxalat de amoniu atunci când soluția de decalcifiere a devenit tulbure, indicând prezența calciului în țesutul osos, astfel încât soluția de decalcifiere a fost înlocuită cu soluție nouă, iar procesul a fost repetat la fiecare 30 de minute până la finalizarea procesului de decalcifiere. Pentru EDTA, s-a folosit testarea fizică a decalcificatorului în care s-a considerat că procesul de decalcifiere s-a încheiat atunci când osul a fost ușor pătruns de un ac. Timpul mediu total decalcificat a fost de 7 ore și 30 de minute, 8 ore și 120 de ore pentru 5% acid azotic, 5% HCl și, respectiv, 10% EDTA.

2.2. Procedura cuptorului cu microunde

a fost utilizat un cuptor cu microunde de casă (Midea microunde 20l, 700W, Digital, EM720CFF) cu o placă rotativă imobiliară. Un pahar de sticlă care conține 100 ml de apă distilată a fost preîncălzit timp de 5 secunde pentru a încălzi magnetronul. Aceasta a fost înlocuită cu 100 ml de apă distilată proaspătă și iradiată pentru a menține temperatura la aproximativ 41-43 centi C. Aceasta a durat 15 secunde. Paharul de sticlă a fost alocat în diferite puncte ale cuptorului în timp ce l-a iradiat pentru a rezolva cea mai bună locație a specimenului în timpul decalcificării cu microunde, deoarece cuptorul cu microunde utilizat a avut o sincronizare constantă, dar nu o temperatură constantă. Trei bucăți de secțiuni de 5 mm grosime de biopsii osoase au fost scufundate în 250 ml Pahare Pyrex Squat conținând 100 ml acid clorhidric apos 5% (HCl), acid azotic apos 5% (HNO3) și 10% EDTA. Apoi, au fost transferate în cuptorul cu microunde, iar exemplarele au fost iradiate timp de zece cicluri de zece secunde fiecare (la intervale de 15 minute) pentru un timp total de 2-4 ore pentru decalcificatoare acide (5% HNO3 și 5% HCl). Temperatura soluției de decalcifiere s-a menținut în jurul valorii de 41-43 C. Soluția de decalcifiere și punctul final de decalcifiere au fost verificate, iar soluția de decalcifiere a fost modificată în mod repetat până la finalizarea decalcificării. Punctul final al decalcificării a fost verificat folosind oxalat de calciu și teste fizice, așa cum s-a menționat mai sus. Timpul mediu total decalcificat a fost de 3 ore și 45 de minute, 5 ore și 30 de minute și 29 de ore și 4 minute pentru 5% acid azotic, 5% HCl și, respectiv, 10% EDTA. După decalcificarea completă, țesuturile au fost spălate cu apă distilată și transferate în soluție de amoniac 0,3% timp de 5 minute pentru a neutraliza acidul utilizat.

2.3. Procesarea și colorarea țesuturilor

probele au fost supuse procesării automate a țesuturilor folosind următoarele protocoale: biopsiile osoase au fost plasate în soluție salină formală 10% timp de o oră. Apoi, 50% alcool o oră, 70% alcool o oră, 90% alcool o oră, urmat de 100% alcool trei modificări la fiecare două ore fiecare, xilen două modificări, fiecare timp de o oră și jumătate, în cele din urmă ceară de parafină două modificări fiecare timp de două ore. Țesuturile au fost înglobate în blocuri de parafină și au fost secționate la o grosime de 5-6 mm cu ajutorul unui Microtom Rotativ. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină a lui Mayer, așa cum a fost descris de Mayer în 1903, iar contra-pata din fiecare a fost de 1% eozină (HE) . Pata lui Gridley a fost folosită pentru demonstrarea ciupercilor așa cum este descris de Gridley în 1953); după deparafinizare și rehidratare, secțiunile de țesut au fost plasate în acid cromic 2% timp de 30 de minute. Apoi au fost spălate bine cu apă de la robinet, clătite cu apă distilată și apoi plasate în reactivul Schiff timp de 20 de minute. Apoi au fost spălate în apă curentă de la robinet timp de 10 minute și clătite cu 70% etanol și apoi cu 95% etanol. Au fost contracarate cu Metanil Galben timp de un minut și clătite bine cu apă distilată. Apoi, au fost deshidratate în xilen și montate în distiren, un plastifiant și xilen (DPX). Apoi, secțiunile au fost examinate la microscop . De asemenea, s-a folosit metoda Grocott hexamine-silver pentru ciuperci, așa cum a fost descrisă de Grocott în 1955, în care secțiunile au fost oxidate cu 4% acid cromic apos timp de o oră, spălate în apă timp de câteva secunde, tratate cu 1% metabisulfit de sodiu timp de un minut, spălate în apă curentă de la robinet timp de 3 minute, clătite bine în apă distilată, plasate în soluție de argint de lucru preîncălzită într-o baie de apă la 60% C timp de 20 minute, clătite bine în apă distilată, spălate cu apă curentă de la robinet timp de 5 minute, contracarate în verde deschis de lucru timp de 15 secunde, deshidratate și eliminate în xilen și montate în DPX, și în cele din urmă examinate la microscop.

2.4. Evaluarea rezultatelor

secțiunile au fost evaluate de un histopatolog expert. Calitatea procedurii de decalcifiere și rezultatul colorării au fost, de asemenea, evaluate și evaluate prin regula generală, iar calitatea decalcificării a fost evaluată prin următoarele criterii: timpul de decalcifiere, conservarea morfologică a morfologiei țesuturilor și ciupercile Madurella mycetomatis de HE; colorarea Gridley și Grocott methenamine-silver a fost clasificată de la 1 la 4 (1: slab, 2: corect, 3: Bun și 4: excelent) .

2.5. Analiza statistică

analiza datelor a fost efectuată utilizând programul SPSS. Unidirecțional ANOVA a fost utilizat pentru a demonstra efectul celor trei soluții de decalcifiere asupra analizei cantitative a calității secțiunilor și a conservării ciupercilor. Testul Kruskal-Wallis a fost efectuat pentru a determina dacă a existat o diferență semnificativă între soluțiile testate pentru fiecare dintre parametrii evaluați împreună cu cele două experimente. Diferențele cu au fost interpretate ca fiind semnificative statistic.

3. Rezultate

cincizeci de cazuri de Madurella mycetomatis cu boabe negre au fost incluse în studiu. Picioarele au fost cea mai afectată regiune anatomică în 48 de cazuri (96%) și două cazuri (4,0%) în mână. În ceea ce privește timpul de decalcifiere în diferite experimente, dintre cele trei soluții testate, decalcificarea cu EDTA 10% (pH 7,4) a durat cel mai mult timp pentru metoda convențională (până la 120 de ore față de 29 de ore cu cuptorul cu microunde), iar utilizarea unei soluții de decalcifiere acidă a durat cel mai scurt timp variind de la 8 ore la 3 ore pentru diferite metode de decalcifiere. Calitatea morfologiei tisulare a diferitelor tipuri de soluții de decalcifiere utilizând metoda decalcificării cu microunde comparativ cu metoda convențională cu colorarea Hematoxilinei și eozinei lui Mayer în ceea ce privește aspectul nuclear și citoplasmatic a obținut rezultate variabile. De asemenea, 10% OS EDTA-decalcificat părea să aibă un rezultat semnificativ superior (valoarea P folosind testul chi-pătrat: 0,023) comparativ cu 5% HNO3 și 5% HCl. Raportul excelent de colorare a fost de 43 (86%) față de 32 (64%), 42 (84%) față de 18 (36%) și, respectiv, 33 (66%) față de 1 (2%). Metoda Grocott methenamine – Silver stain a fost utilizată pentru demonstrarea agentului cauzal Madurella mycetomatis în ceea ce privește morfologia și luminozitatea ciupercilor, iar secțiunile de țesut decalcificate cu 10% EDTA, 5% HNO3 și 5% HCl folosind metode convenționale și cu microunde au arătat o morfologie fungică semnificativ mai bună (valoarea P folosind testul chi-pătrat: 0,001) după cum urmează: 33 (66%) 32 (64%), 33 (66%) comparativ cu 39 (78%) și, respectiv, 22 (44%) comparativ cu 31 (62%). Cealaltă pată fungică utilizată pentru Madurella mycetomatis a fost pata Gridley privind morfologia fungică și calitatea colorării oaselor decalcificate cu 10% EDTA, 5% HNO3 și 5% HCl folosind metodele convenționale și cu microunde, care au arătat rezultate semnificativ mai bune (valoarea P folosind testul chi-pătrat: 0,003) după cum urmează: 43 (86%) față de 41 (82%), 32 (64%) comparativ cu 34 (68%), respectiv 23 (46%) comparativ cu 35 (70%). Aceste rezultate sunt rezumate în tabelul 2. Figura 1 prezintă rezultatele colorării folosind diferiți agenți și condiții de decalcifiere.

Figura 1

demonstrarea rezultatelor colorării utilizând diferiți agenți și condiții de decalcifiere.

4. Discuție

identificarea histopatologică a agentului cauzal al Madurella mycetomatis este bine stabilită, deoarece este procedura standard de aur; cu toate acestea, țesutul dur și osul necesită o decalcifiere specială pentru a păstra structura țesutului și morfologia agentului cauzal. Agenții cauzali pot fi identificați folosind pete speciale de hematoxilină și eozină (HE) și ciuperci, astfel încât osul necesită un protocol standard de decalcifiere care păstrează țesutul, morfologia agentului cauzal și capacitatea de colorare. Decalcificarea oaselor este o tehnică obositoare. Este nevoie de săptămâni, iar conservarea configurației țesutului depinde de excelența și viteza procedurii de decalcifiere. Un nou proces folosind un cuptor cu microunde a fost realizat pentru a accelera procesul de decalcifiere . Selectarea agentului de decalcifiere și a modului este determinată în principiu de seriozitatea metodei , iar posibilele utilizări ale energiei cu microunde în tehnicile histologice au fost documentate pentru prima dată de Mayers în 1970. Acest sistem de neionizare metoda de emisie gândit la accelerarea procesului de decalcifiere . Cinetica moleculară determină apoi producerea de schimbări de energie, care durează până când radiația se oprește . În acest studiu, timpii de decalcifiere raportați pentru decalcificarea îmbunătățită cu microunde și procedura convențională de decalcifiere au fost de 29 și 120 de ore cu 10% EDTA (pH 7,4), trei ore și șapte ore cu 5% acid azotic și, respectiv, cinci și opt ore cu 5% HCl. Este clar că metoda de decalcifiere cu microunde pentru țesutul osos afectat de infecția cu micetom a fost semnificativ mai rapidă decât metoda convențională. De asemenea, 5% acid azotic a avut o capacitate de decalcifiere mai rapidă, urmată de 5% acid clorhidric și apoi EDTA (pH 7,4) pentru ambele metode. Pitol și colab. a folosit un aragaz cu microunde pentru îndepărtarea calciului osului de șobolan cu soluție EDTA de 8,5% și a afișat o scădere a perioadei de încercare de la 45 de zile în procesul convențional la 48 de ore în procesul asistat de microunde. În această lucrare, soluția EDTA 10% a durat 120 de ore în metoda convențională și 29 de ore folosind microunde pentru a obține decalcificarea completă a țesutului osos afectat de infecția cu micetom. Concentrația EDTA în experimentul nostru a fost mai mare decât Pitol și colab.studiul lui. În plus față de diferențele de dimensiune, grosime și tipuri de os, acestea pot fi posibile explicații pentru creșterea timpului de decalcifiere în Pitol și colab.studiu care au fost reduse în setarea noastră. Mai mult, decalcificarea osului afectat de infecția cu micetom cu metoda convențională folosind acid azotic 5% a durat șapte ore, în timp ce metoda cuptorului cu microunde a durat trei ore. Rezultate comparabile au fost obținute de Balaton și Loget . Mai mult, în această cercetare, timpii de decalcifiere au fost reduși față de alte studii. Timpii de decalcifiere raportați pentru metodele convenționale și cu microunde au variat de la o zi și patru ore până la 5 zile și sunt considerați mici în comparație cu alte studii efectuate pe osul rozătoarelor, care au raportat timpi între 2 și 7 zile cu soluții de decalcifiere acidă și, respectiv, 10% EDTA (pH 7,4). Shibata și grupul său au raportat timpi de decalcifiere aproape similari, care au variat de la 1 zi la 7 zile cu 10% HCl, 10% acid azotic și 10% EDTA. Cu toate acestea, au folosit decalcificatoare acide cu concentrații mai mari . Uma și colab. a evaluat efectele a patru lichide de decalcifiere diferite folosind decalcificarea cu microunde în osul șobolanului și a raportat 1 până la 1,5 zile pentru 5% acid azotic și 7% HCl/2% EDTA. Cu toate acestea, 10% EDTA a durat 14 până la 26 de zile în funcție de tipul osului . În aceste studii, tipul, natura și dimensiunea osului au variat și au diferit de cele analizate aici. Procedura de decalcifiere a fost un motiv cheie pentru superioritatea secțiunii de țesut și precizia colorării. Philipp și colab. (2019) a descris că metoda de decalcifiere provoacă modificări morfologice semnificative care modifică structura proteinei și afectează capacitatea de colorare a țesutului . În studiul nostru, osul a fost tratat cu acid azotic 5% cu metoda manuală de rutină și a existat umflarea țesuturilor moi și pierderea colorării nucleare și fungice în comparație cu decalcificarea asistată de microunde. Agenții de decalcifiere a acidului perturbă de obicei Constanța oaselor și a țesuturilor moi. Aceste efecte speciale în acidul azotic 5% se datorează perioadei luate și acidității soluției. Astfel, decalcifierea mai rapidă va provoca vătămări mai mari și efecte mai mari în H&E și pete speciale fungice. Mai multe ciuperci pot fi demonstrate cu o secțiune histologică folosind pete histochimice, cum ar fi pata de metenamină-argint (GMS) a lui Grocott și/sau pata Gridley (GS). Unele ciuperci pot fi demonstrate exact în țesut pe baza structurilor morfologice; cu toate acestea, eficacitatea recunoașterii a avut tendința de a scădea după fixarea prelungită și decalcifierea folosind metode convenționale . În acest studiu, decalcificarea asistată de microunde a dat o colorare superioară în comparație cu metoda convențională de morfologie folosind H&e și pata specială fungică, unde 10% EDTA a fost soluția care a conservat cel mai bine structurile tisulare și capacitatea de colorare fungică, în ciuda faptului că a durat mult timp pentru decalcifiere.

5. Concluzii și recomandări

decalcificarea îmbunătățită prin utilizarea unui cuptor cu microunde este o nouă tehnică de decalcifiere. Această tehnică a fost investigată în țesutul osos afectat de infecția cu Madurella mycetomatis utilizând 10% EDTA, 5% acid azotic și 5% acid clorhidric ca fluide de decalcifiere. Acest lucru a fost comparat cu decalcificarea convențională la temperatura camerei pentru a determina viteza decalcificării și morfologia țesuturilor folosind pata de hematoxilină și eozină a lui Mayer pentru structura osoasă și petele Grocott și Gridley pentru morfologia fungică. Rezultate mai bune au fost obținute în comparație cu metoda convențională atât în morfologia celulară, cât și în sporii fungici și hifele cu luminozitate scăzută a ciupercilor la temperatura camerei. Această constatare poate ajuta la elaborarea unor protocoale adecvate pentru analizele țesutului osos afectat de infecția cu micetom.

6. Limitările prezentului studiu

o dimensiune mai mare a eșantionului ar fi dat rezultate mai concludente. De asemenea, timpii luați pentru decalcifiere sunt probabil diferiți dacă se utilizează greutăți osoase diferite și probe osoase, altele decât mâinile, deoarece timpul de decalcifiere depinde de dimensiunea și densitatea structurală a țesutului dur. În cele din urmă, deoarece am folosit un cuptor cu microunde intern, este posibil ca înregistrările noastre de temperatură să fi fost doar aproximative.

disponibilitatea datelor

seturile de date generate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător la cerere rezonabilă.

aprobare etică

acest studiu a fost aprobat de Consiliul de revizuire instituțională a Facultății de științe Medicale de laborator, Universitatea din Al Neelain.

conflicte de interese

autorul declară că nu există conflicte de interese.

mulțumiri

autorul dorește să-și exprime recunoștința sinceră personalului Centrului de cercetare Mycetoma, Universitatea din Khartoum, Khartoum, Sudan, și apreciere specială profesorilor Ahmed Hassan Fahal și Ahmed Mohammed El Hassan, profesor emerit de patologie, pentru ajutorul acordat.

materiale suplimentare

materialele și reactivii utilizați pentru a susține rezultatele acestui studiu sunt incluși în informațiile suplimentare. (Materiale Suplimentare)