10.4.2 trehaloză pentru crioprezervarea celulelor de mamifere
crioprezervarea a fost folosită în mod obișnuit pentru conservarea celulelor pe perioade lungi la temperaturi extrem de scăzute. Cu toate acestea, schimbările fizice care apar în timpul înghețării și dezghețării pot fi dăunătoare supraviețuirii și funcțiilor celulare. Prin urmare, crioprotectorii trebuie adăugați la celule în timpul crioconservării. Utilizarea trehalozei ca crioprotector pentru celule a apărut din noțiunea că compușii polihidroxi sunt necesari pe ambele părți ale membranei celulare pentru ca celulele să fie conservate pentru perioade mai lungi . Trehaloza a fost explorată de mai multe grupuri ca protector pentru crioconservarea diferitelor celule umane.
Beattie și colab. a introdus trehaloza împreună cu DMSO în celulele Langerhans pancreatice utilizând tranziția termotropică a fazei lichide . Crioconservarea cu trehaloză a dus la recuperarea A 92% din Insulele adulte, comparativ cu doar 58% recuperare folosind DMSO singur. De paisprezece ori mai multă insulină a fost găsită în grefele din Insulele crioprezervate cu trehaloză decât cele fără trehaloză. Recuperarea clusterelor de celule asemănătoare insulelor fetale umane (ICC) crioprezervate cu trehaloză a fost de 94%, comparativ cu doar 42% pentru cei fără trehaloză. Când a fost transplantat la șoareci nud, s-a observat o creștere de 15 ori a conținutului de insulină al grefelor din ICC crioprezervat cu trehaloză. Aceste rezultate indică faptul că adăugarea de trehaloză ca crioconservant duce la rate de supraviețuire foarte mari ale țesutului endocrin pancreatic uman.
tonerul și colegii au introdus concentrații scăzute de trehaloză în celulele mamiferelor folosind o versiune modificată genetic a proteinei alfa-hemolizină care formează pori și au constatat că trehaloza intracelulară poate îmbunătăți considerabil supraviețuirea acestor celule în timpul crioconservării . Ratele de supraviețuire post-dezgheț pe termen lung ale fibroblastelor crioprezervate de șoarece și ale keratinocitelor umane au fost de 80% și, respectiv, 70%, la o concentrație intracelulară de trehaloză de 0,2 M. S-a constatat, de asemenea, că trehaloza intracelulară are un efect benefic asupra integrității membranei celulelor de mamifere uscate, cu o recuperare de peste 90% a membranei plasmatice intacte observată la uscarea și depozitarea celulelor în condiții ușoare timp de câteva săptămâni .
efectul trehalozei asupra crioconservării hepatocitelor umane a fost investigat de Katenz și colab. . Celulele hepatice congelate în mediu de cultură cu 10% DMSO și 0,2 M trehaloză au prezentat o îmbunătățire semnificativă a viabilității celulelor post-dezgheț și a eficienței placării comparativ cu DMSO singur. Prezența trehalozei în timpul crioconservării a dus, de asemenea, la creșterea nivelului total de proteine în celulele atașate, la niveluri mai mari de secreție a albuminei și la niveluri mai mici de aspartat amino transferază după decongelare.
celulele Stem sunt instrumente importante pentru investigarea hematopoiezei, dezvoltarea de noi strategii terapeutice, precum și sisteme model pentru anumite boli. În ciuda evoluțiilor în crioconservare, moartea celulelor post-dezgheț rămâne o problemă majoră. Martinetti și colab. trehaloza utilizată pentru crioprezervarea tulpinii hematopoietice pure și a celulelor progenitoare din sângele periferic pentru a preveni pierderea celulelor care apare în cursul normal al crioprezervării . Expresia markerului tulpinii de suprafață CD34 a fost evaluată și s-a constatat că 1 m trehaloză oferă crioprotecție îmbunătățită celulelor CD34+ cu număr de celule și viabilitate celulară mai mari în comparație cu metoda standard de congelare folosind DMSO. Mai mult, crioconservarea cu trehaloză pentru perioade mai scurte și mai lungi a păstrat capacitatea celulelor CD34+ de a se diferenția în celule megacariopoietice după decongelare. Aceste rezultate sugerează capacitatea trehalozei de a păstra viabilitatea și funcțiile celulelor stem atunci când este utilizată ca crioprotector.
depozitarea pe termen lung a globulelor roșii și a trombocitelor, menținând în același timp un grad ridicat de viabilitate, are implicații importante în transfuzia de sânge și în medicina clinică. Satpathy și colab. a descris o metodă de încărcare a RBC-urilor cu trehaloză dintr-un mediu extracelular folosind dezechilibru osmotic și tranziție de fază fosfolipidică care a dus la concentrații intracelulare de trehaloză de 40 mM . S-a constatat că trehaloza exercită protecție osmotică a RBC-urilor pentru perioade mai lungi. Uscarea prin congelare a RBC-urilor încărcate cu trehaloză urmată de rehidratare a dus la o supraviețuire de 55% cu păstrarea morfologiei lor. Celulele supraviețuitoare au sintetizat ATP și 2,3-difosfoglicerat (DPG) și au avut niveluri scăzute de methemoglobină. Activitatea SOD și catalazei și structura secundară a hemoglobinei în RBC-urile liofilizate au fost toate foarte asemănătoare cu cele ale RBC-urilor proaspete. Acest studiu a demonstrat că încărcarea cu trehaloză a fost necesară pentru stabilizarea hemoglobinei și a oferit un pas important spre crioconservarea RBC-urilor.
timpul normal de depozitare a trombocitelor din sânge uman în băncile de sânge este de 5 zile după care sunt aruncate, ducând la lipsa cronică de trombocite necesare transfuziei. Ca un efort spre crioconservarea trombocitelor pentru perioade mai lungi, Wolkers și colab. a descris o metodă de introducere a trehalozei în citoplasma trombocitelor din sângele uman . S-a constatat că trehaloza este ușor absorbită de trombocitele umane la 37 centicc, cu o eficiență de încărcare mai mare de 50%. Uscarea prin congelare și rehidratarea trombocitelor încărcate cu trehaloză au dus la o recuperare excelentă a trombocitelor intacte cu o rată de supraviețuire de 85%. Aceste trombocite au răspuns într-o manieră aproape identică cu trombocitele proaspete față de agoniști precum trombina, ADP, colagenul și ristocetina. Microdomenele membranare și componentele proteice ale trombocitelor încărcate cu trehaloză au fost menținute intacte după liofilizare și rehidratare.
efectul protector al trehalozei a fost demonstrat și în celulele epiteliale corneene desicate. Preincubarea celulelor epiteliale corneene cultivate cu trehaloză urmată de uscare a dus la o reducere semnificativă a procentului de celule moarte, comparativ cu mediul martor . Efectul protector a fost, de asemenea, confirmat ex vivo în ochii porcini enucleați, unde țesutul incubat cu trehaloză a fost vizibil mai fin . Aceste rezultate indică utilitatea trehalozei în oftalmologie și aplicarea sa potențială ca picătură de ochi pentru sindromul de ochi uscat.
utilizarea trehalozei pentru crioconservarea organelor a fost demonstrată de Yamaguchi și colab., care a folosit trehaloza ca crioprotector pentru mitocondriile înghețate . Mitocondriile înghețate în prezența trehalozei au prezentat integritatea membranei exterioare mitocondriale (MOM) și capacitatea de reacție la proteinele familiei Bcl-2 similare cu cele ale mitocondriilor proaspete. Ultrastructura, sinteza ATP, potențialul transmembranar, umflarea indusă de calciu și importul și prelucrarea proteinelor precursoare au fost, de asemenea, conservate în prezența trehalozei. Acest lucru este diferit de tamponul standard de zaharoză-manitol utilizat pentru înghețarea mitocondriilor care adesea devine scurgeră. Astfel, trehaloza a fost capabilă să păstreze majoritatea caracteristicilor biologice ale mitocondriilor și mitocondriile înghețate de trehaloză pot fi utilizate pentru cercetarea apoptozei și a altor funcții mitocondriale care se bazează pe integritatea mamei.
trehaloza a fost utilizată pentru conservarea organelor pe perioade lungi de timp. O” soluție ET-Kyoto ” a fost dezvoltată de grupul Wada pentru conservarea plămânului Canin pentru >30 de ore fără a afecta performanța celulelor endoteliale și a vascularizației . Stabilizarea prelungită și conservarea vaccinurilor și a anticorpilor au fost, de asemenea, realizate folosind trehaloză.
