Metode de purificare a proteinelor: 4 metode

acest articol aruncă lumină asupra celor patru metode de purificare a proteinelor.

cele patru metode de purificare a proteinelor sunt: (1) extracție (2) Precipitare și solubilizare diferențială (3) ultracentrifugare și (4)metode cromatografice.

metodele utilizate în purificarea proteinelor pot fi împărțite aproximativ în metode analitice și preparative.

distincția nu este exactă, dar factorul decisiv este cantitatea de proteine, care poate fi practic purificată cu această metodă. Metodele analitice au ca scop detectarea și identificarea unei proteine dintr-un amestec, în timp ce metodele preparative au ca scop producerea unor cantități mari de proteine în alte scopuri, cum ar fi biologia structurală sau utilizarea industrială. În general, metodele preparative pot fi utilizate în aplicații analitice, dar nu invers.

Metoda # 1. Extracție:

în funcție de sursă, proteina trebuie adusă în soluție prin ruperea țesutului sau a celulelor care o conțin. Există mai multe metode pentru a realiza acest lucru; congelare repetată și decongelare, Sonicare, omogenizare prin presiune ridicată sau permeabilizarea prin solvenți organici. Metoda de alegere depinde de cât de fragilă este proteina și de cât de robuste sunt celulele.

după acest proces de extracție, proteina solubilă va fi în solvent și poate fi separată de membranele celulare, ADN etc. prin centrifugare. Procesul de extracție extrage, de asemenea, proteaze, care vor începe digerarea proteinelor din soluție. Dacă proteina este sensibilă la proteoliză, este de obicei de dorit să se procedeze rapid și să se mențină extractul răcit, pentru a încetini proteoliza.

Metoda # 2. Precipitarea și solubilizarea diferențială:

în purificarea proteinelor în vrac, un prim pas comun pentru izolarea proteinelor este precipitarea cu sulfat de amoniu (NH4)2SO4. Acest lucru se realizează prin adăugarea unor cantități crescânde de sulfat de amoniu și colectarea diferitelor fracțiuni de proteine precipitate. Un avantaj al acestei metode este că poate fi realizat ieftin cu volume foarte mari.

primele proteine care trebuie purificate sunt proteinele solubile în apă. Purificarea proteinelor membranare integrale necesită întreruperea membranei celulare pentru a izola orice proteină particulară de altele care se află în același compartiment de membrană. Uneori, o anumită tracțiune a membranei poate fi izolată mai întâi, cum ar fi izolarea mitocondriilor de celule înainte de purificarea unei proteine situate într-o membrană mitocondrială.

un detergent, cum ar fi sulfatul de dodecil de sodiu (SDS), poate fi utilizat pentru a dizolva membranele celulare și pentru a menține proteinele membranare în soluție în timpul purificării; cu toate acestea, deoarece SDS provoacă denaturarea, detergenții mai blânzi, cum ar fi Triton X-100 sau CHAPS, pot fi utilizați pentru a reține conformația nativă a proteinei în timpul purificării.

metoda # 3. Ultracentrifugarea:

centrifugarea este un proces care utilizează forța centrifugă pentru a separa amestecurile de particule de mase sau densități variabile suspendate într-un lichid. Când un vas (de obicei un tub sau o sticlă) care conține un amestec de proteine sau alte particule, cum ar fi celulele bacteriene, este rotit la viteze mari, momentul unghiular produce o forță exterioară fiecărei particule care este proporțională cu masa sa.

tendința unei particule date de a se deplasa prin lichid din cauza acestei forțe este compensată de rezistența pe care lichidul o exercită asupra particulei. Efectul net al” rotirii „probei într-o centrifugă este că particulele masive, mici și dense se deplasează spre exterior mai repede decât particulele mai puțin masive sau particulele cu mai multă” tragere ” în lichid.

când suspensiile de particule sunt „filate” într-o centrifugă, se poate forma o „peletă” la fundul vasului care este îmbogățită pentru cele mai masive particule cu rezistență redusă în lichid. Particulele rămase, necompactate, care rămân în mare parte în lichid sunt numite „supernatant” și pot fi îndepărtate din vas pentru a separa supernatantul de peletă.

viteza de centrifugare este specificată de accelerația unghiulară aplicată eșantionului, măsurată de obicei în comparație cu g. dacă eșantioanele sunt centrifugate suficient de mult, particulele din vas vor ajunge la echilibru în care particulele se acumulează în mod specific într-un punct al vasului în care densitatea lor plutitoare este echilibrată cu forța centrifugă. O astfel de centrifugare” de echilibru ” poate permite purificarea extinsă a unei particule date.

centrifugare cu gradient de zaharoză:

un gradient de concentrație liniară de zahăr (de obicei zaharoză glicerol, sau Percoll) este generat într-un tub astfel încât cea mai mare concentrație este în partea de jos și cea mai mică în partea de sus. O probă de proteine este apoi stratificată deasupra gradientului și rotită la viteze mari într-un ultracentrifugă. Acest lucru face ca macromoleculele grele să migreze spre fundul tubului mai repede decât materialul mai ușor.

în timpul centrifugării în absența zaharozei, pe măsură ce particulele se deplasează din ce în ce mai departe de centrul de rotație, ele experimentează din ce în ce mai multă forță centrifugă (cu cât se mișcă mai departe, cu atât se mișcă mai repede). Problema cu aceasta este că intervalul de separare util din interiorul navei este limitat la o mică fereastră observabilă.

învârtirea unei probe de două ori mai lungă nu înseamnă că particula de interes va merge de două ori mai departe; de fapt, va merge semnificativ mai departe. Cu toate acestea, atunci când proteinele se deplasează printr-un gradient de zaharoză, întâlnesc lichid cu densitate și vâscozitate crescătoare.

un gradient de zaharoză proiectat corespunzător va contracara forța centrifugă în creștere, astfel încât particulele se mișcă aproape proporțional cu timpul în care au fost în câmpul centrifugal. Probele separate de acești gradienți sunt denumite centrifugări „zonale de viteză”. După separarea proteinei/particulelor, gradientul este apoi fracționat și colectat.

Metoda # 4. Metode cromatografice:

de obicei, un protocol de purificare a proteinelor conține unul sau mai mulți pași cromatografici. Procedura de bază în cromatografie este de a curge soluția care conține proteina printr-o coloană ambalată cu diverse materiale. Diferite proteine interacționează diferit cu materialul coloanei și pot fi astfel separate de timpul necesar pentru a trece coloana sau de condițiile necesare pentru a Eluta proteina din coloană. De obicei, proteinele sunt detectate pe măsură ce ies din coloană prin absorbanța lor la 280 nm.

există multe metode cromatografice diferite:

1. Cromatografia de Excludere a mărimii:

cromatografia poate fi utilizată pentru a separa proteinele în soluție sau în condiții de denaturare prin utilizarea gelurilor poroase. Această tehnică este cunoscută sub numele de cromatografie de excludere a mărimii. Principiul este că moleculele mai mici trebuie să traverseze un volum mai mare într-o matrice poroasă. În consecință, proteinele cu o anumită dimensiune vor necesita un volum variabil de eluant (solvent) înainte de a fi colectate la celălalt capăt al coloanei de gel.

în contextul purificării proteinelor, eluantul este de obicei grupat în eprubete diferite. Toate eprubetele care nu conțin urme măsurabile de proteină de purificat sunt aruncate. Soluția rămasă este astfel făcută din proteine pentru a purifica și orice alte proteine de dimensiuni similare.

2. Cromatografie cu Schimb de ioni:

cromatografia cu schimb de ioni separă compușii în funcție de natura și gradul sarcinii lor ionice. Coloana care urmează să fie utilizată este selectată în funcție de tipul și puterea de încărcare. Rășinile schimbătoare de anioni au o sarcină pozitivă și sunt utilizate pentru a reține și separa kilogramele com încărcate negativ, în timp ce rășinile schimbătoare de cationi au o sarcină negativă și sunt utilizate pentru a separa moleculele încărcate pozitiv.

înainte de începerea separării, un tampon este pompat prin coloană pentru a echilibra ionii încărcați opuși. La injectarea probei, moleculele de solut se vor schimba cu ionii tampon pe măsură ce fiecare concurează pentru locurile de legare de pe rășină. Durata de retenție pentru fiecare solut depinde de puterea încărcăturii sale.

compușii cei mai slab încărcați vor Eluta mai întâi, urmați de cei cu sarcini succesiv mai puternice. Datorită naturii mecanismului de separare, pH-ul, Tipul tampon, concentrația tamponului și temperatura joacă toate roluri importante în controlul separării. Cromatografia cu schimb de ioni este un instrument foarte puternic pentru utilizarea în purificarea proteinelor și este frecvent utilizată atât în separările analitice, cât și în cele preparative.

3. Cromatografie De Afinitate:

cromatografia de afinitate este o tehnică de separare bazată pe Conformație moleculară, care utilizează frecvent rășini specifice aplicării. Aceste rășini au liganzi atașați la suprafețele lor, care sunt specifici pentru compușii care trebuie separați. Cel mai frecvent, acești liganzi funcționează într-un mod similar cu cel al interacțiunilor anticorp-antigen. Această” blocare și cheie ” se potrivește între ligand și compusul său țintă îl face foarte specific, generând frecvent un singur vârf, în timp ce toate celelalte din eșantion nu sunt reținute.

multe proteine membranare sunt glicoproteine și pot fi purificate prin cromatografia afinității lectinei. Proteinele solubilizate în Detergent pot fi lăsate să se lege de o rășină cromatografică care a fost modificată pentru a avea o lectină atașată covalent.

proteinele care nu se leagă de lectină sunt spălate și apoi glicoproteinele legate în mod specific pot fi eluate prin adăugarea unei concentrații ridicate de zahăr care concurează cu glicoproteinele legate la locul de legare a lectinei. Unele lectine au o afinitate ridicată de legare la oligozaharidele glicoproteinelor, care este greu de concurat cu zaharurile, iar glicoproteinele legate trebuie eliberate prin denaturarea lectinei.

4. Legarea metalelor:

o tehnică comună implică ingineria unei secvențe de 6 până la 8 histidine în terminalul C al proteinei. Polihistidina se leagă puternic de ionii metalici bivalenți, cum ar fi nichelul și cobaltul. Proteina poate fi trecută printr-o coloană care conține ioni de nichel imobilizați, care leagă eticheta de polihistidină. Toate proteinele neetichetate trec prin coloană.

proteina poate fi eluată cu imidazol, care concurează cu eticheta polihistidină pentru legarea la coloană sau printr-o scădere a pH-ului (de obicei la 4,5), care scade afinitatea etichetei pentru rășină. În timp ce această procedură este utilizată în general pentru purificarea proteinelor recombinante cu o etichetă de afinitate proiectată (cum ar fi o etichetă 6xHis sau eticheta pălăriei Clontech), poate fi utilizată și pentru proteine naturale cu o afinitate inerentă tor cationi divalenți.

5. Cromatografia Imunoafinității:

cromatografia Imunoafinității utilizează legarea specifică a unui anticorp de proteina țintă pentru a purifica selectiv proteina. Procedura implică imobilizarea unui anticorp la un material de coloană, care apoi leagă selectiv proteina, în timp ce orice altceva curge. Proteina poate Ix eluat prin schimbarea pH-ului sau a salinității. Deoarece această metodă nu implică inginerie într-o etichetă, ea poate fi utilizată pentru proteine din surse naturale.

6. HPLC:

cromatografia lichidă de înaltă performanță sau cromatografia lichidă de înaltă presiune este o formă de cromatografie care aplică presiune ridicată pentru a conduce substanțele dizolvate prin coloană mai repede. Aceasta înseamnă că difuzia este limitată și rezoluția este îmbunătățită. Cea mai comună formă este „faza inversată” HPLC, unde materialul coloanei este hidrofob.

proteinele sunt eluate de un gradient de cantități crescânde de solvent organic, cum ar fi acetonitrilul. Proteinele se eluează în funcție de hidrofobicitatea lor. După purificarea prin HPLC, proteina se află într-o soluție care conține numai compuși volatili și poate fi ușor liofilizată. Purificarea HPLC duce frecvent la denaturarea proteinelor purificate și, prin urmare, nu se aplică proteinelor care nu se reumple spontan.