colorarea multicoloră cu coloranți fluorescenți este utilizată în mod activ pentru observarea distribuției materialelor biologice (cum ar fi proteine, lipide, acizi nucleici și ioni) în domeniul cercetării țesuturilor și celulelor. Tehnologia de detectare pentru observarea fluorescenței a avansat la un nivel la care o singură moleculă de colorant fluorescent poate fi detectată în cele mai bune circumstanțe. Această secțiune trece în revistă câteva dintre aspectele importante ale microscopiei imagistice fluorescente pe viață (FLIM), o nouă tehnologie de microscopie fluorescentă. În plus față de colorarea multicoloră, imagistica pe durata de viață a fluorescenței poate fi utilizată și pentru a vizualiza factorii care afectează proprietățile de viață a fluorescenței moleculei de colorant, adică starea mediului din jurul moleculei.
spectroscopie de lungime de undă
microscopia fluorescentă convențională folosește proprietățile de culoare ale coloranților fluorescenți, adică identificarea se bazează pe diferențele de caracteristici spectrale de fluorescență între coloranți. Cu această tehnică, cinci sau șase coloranți în gama de lungimi de undă de la ultra violet la infraroșu apropiat pot fi utilizați simultan sub microscopie fără confuzie între culori.
spectroscopie de viață
fiecare colorant fluorescent are propria durată de viață în starea excitată. Prin detectarea diferențelor în timpul vieții, este posibil să se distingă chiar și coloranții care au aceeași culoare fluorescentă, precum și să se identifice autofluorescența. În plus, imaginile semnal-zgomot ridicate pot fi obținute prin utilizarea unei sonde cu o durată de viață foarte lungă în comparație cu cea a coloranților fluorescenți utilizați în mod normal. De exemplu, coproporfirina de platină are o durată de viață de ordinul milisecundelor, în timp ce durata de viață a coloranților fluorescenți obișnuiți este de ordinul nanosecundelor. Astfel de coloranți fluorescenți relativ lungi vor fi folosiți în curând ca sonde pentru detectarea ADN-ului pe cipuri.
imagistica prin fluorescență pe viață face, de asemenea, posibilă obținerea de informații despre molecule în timp ce se observă o celulă vie. Factorii care afectează durata de viață a fluorescenței includ intensitatea ionilor, proprietățile hidrofobe, concentrația de oxigen, legarea moleculară și interacțiunea moleculară prin transfer de energie atunci când două proteine se apropie una de cealaltă. Durata de viață este, totuși, independentă de concentrația colorantului, fotobleaching, împrăștierea luminii și intensitatea luminii de excitație. Prin urmare, imagistica pe durata de viață a fluorescenței ne permite să efectuăm măsurători precise ale concentrației de ioni și analiza transferului de energie prin rezonanță fluorescentă (FRET).
există două metode de imagistică pe durata de viață a fluorescenței: metoda domeniului de timp și metoda domeniului de frecvență.
- domeniul temporal FLIM-în unele cazuri de întârziere după excitație de către un laser cu impulsuri, imaginea fluorescentă poate fi obținută prin funcționarea porții intensificatorului de imagine. Durata de viață este măsurată în nanosecunde de un laser cu o durată a impulsului de câteva sute de picosecunde și un obturator la nivel de nanosecundă, deoarece durata de viață a unei stări de excitație este de obicei de 1 până la 20 de nanosecunde. Un intensificator de imagine de mare viteză este disponibil comercial de la Hamamatsu Photonics K. K. (Hamamatsu, Japonia). Durata de viață a fluorescenței la fiecare pixel poate fi obținută și prin măsurarea în timp ce variază timpul de întârziere până când se deschide o poartă. Imaginile de viață fluorescente sunt prezentate în pseudocolor în funcție de durata lor de viață.
- domeniul de frecvență FLIM-fluorescență durata de viață este calculată prin măsurarea schimbării de fază a fluorescenței și reducerea amplitudinii sale folosind un detector cu un modulator de câștig atunci când laserul utilizat ca sursă de lumină de excitație este modulată (1 până la 200 megahertzi). Măsurarea poate fi efectuată fie prin scanare laser (fotomultiplicator), fie folosind un dispozitiv cuplat la Încărcare (CCD).
Aplicații
mediul înconjurător al sondei este detectat pe baza faptului că durata de viață a fluorescenței este sensibilă la concentrația de ioni de hidrogen (pH), oxigen și concentrații de ioni de calciu. Legarea sau interacțiunea dintre molecule pot fi, de asemenea, măsurate în combinație cu FRET.
imagistica concentrației de ioni de calciu
când ionul de calciu se leagă de o sondă fluorescentă, cum ar fi Fura-2, Fluo-3 sau verde de calciu, atât durata de viață a fluorescenței, cât și intensitatea fluorescenței se schimbă. Procedura convențională pentru măsurarea concentrației de ioni se concentrează pe schimbarea intensității. În funcție de modificarea concentrației de ioni de calciu, raportul dintre coloranți între ionul de calciu legat și nelegat se modifică, ceea ce duce ulterior la o modificare a duratei de viață a fluorescenței punctului de măsurare din specimen. În plus față de sonda de ioni de calciu, această tehnică este aplicabilă și măsurării pH-ului și a altor ioni, cum ar fi ionul de sodiu și ionul de magneziu.
transfer de energie prin rezonanță fluorescentă (FRET)
cercetările se desfășoară în prezent pe FRET prin variante de proteine fluorescente verzi (GFP) (GFP cu o culoare fluorescentă diferită). FRET face posibilă măsurarea interacțiunilor (asociere sau disociere) între două proteine care sunt etichetate cu o pereche de coloranți fluorescenți. Un colorant fluorescent donator are lungimi de undă de excitație/emisie mai scurte care furnizează energie unui colorant fluorescent acceptor. Durata de viață a stării de excitație a colorantului donator este variabilă în funcție de existența sau nu a acceptorului (colorantul care primește energia). Măsurarea bazată pe durata de viață permite o cuantificare mai bună, deoarece nu este necesar să se ia în considerare suprapunerea fluorescenței în timpul detectării.
imagistica clinică
deoarece unele probe de țesut și citodiagnostic au autofluorescență puternică, s-a încercat utilizarea sondelor cu durată lungă de viață (până la milisecunde). Sondele cu durată lungă de viață sunt, de asemenea, utile în hibridizarea fluorescentă in situ (pește), deoarece numărul de culori care pot fi utilizate simultan este limitat cu această tehnică. Concentrația ionilor de hidrogen din sânge, precum și presiunile de oxigen și dioxid de carbon, au fost deja măsurate pe baza duratei de viață a fluorescenței, deși astfel de măsurători nu sunt încă posibile sub microscopie.
resurse Internet
- Centrul de spectroscopie fluorescentă – găzduit de profesorul Joseph R. Lakowicz de la Universitatea din Maryland, acest site web este o resursă excelentă pentru informații despre imagistica prin fluorescență pe viață și alte aspecte ale spectroscopiei și microscopiei fluorescente.
- Kentech Instruments – Kentech produce generatoare de impulsuri de înaltă tensiune în stare solidă și sisteme optice inchisa imagistica pentru imagistica fluorescenta durata de viață.
- Hamamatsu Photonics – în plus față de gama lor excelentă de sisteme de camere digitale, Hamamatsu produce, de asemenea, fotomultiplicatoare, fotodiode avalanche și intensificatoare de imagine de mare viteză.
- PRS BioSciences – specializata in microscopie fluorescenta biologica, PRS BioSciences produce un sistem aftermarket timp inchisa, care poate fi adaptat la multe Microscoape de cercetare.
