rezumat
virusul gripal neuraminidaza (NA) joacă un rol esențial în eliberarea și răspândirea virionilor descendenți, în urma ciclului de replicare virală intracelulară. Pentru a testa dacă NA ar putea facilita, de asemenea, intrarea virusului în celulă, am infectat culturi ale epiteliului căilor respiratorii umane cu virusuri ale gripei umane și aviare în prezența inhibitorului NA oseltamivir carboxilat. Douăzeci până la 500 de ori mai puține celule s-au infectat în culturile tratate cu medicamente față de cele netratate (P < 0,0001) la 7 ore după aplicarea virusului, indicând faptul că medicamentul a suprimat inițierea infecției. Aceste date demonstrează că NA virală joacă un rol timpuriu în infecție și oferă o justificare suplimentară pentru utilizarea profilactică a inhibitorilor de NA.
se crede că funcția majoră a neuraminidazei virale (NA) se află în stadiul final al infecției atunci când NA scindează acidul sialic de pe suprafața celulară și virionii descendenți care facilitează eliberarea virusului din celulele infectate (1, 2). Se știe mai puțin despre funcțiile NA în timpul intrării virusului în celulă. S-a presupus mult timp că NA promovează accesul virusului la celulele țintă din căile respiratorii prin degradarea mucusului (3). Cu toate acestea, acest concept nu a fost niciodată dovedit formal din cauza lipsei unui sistem experimental adecvat. Mai mult, au fost raportate unele dovezi care argumentează împotriva rolului NA în stadiile incipiente ale infecției (revizuite în referința 2).
pentru a aborda această problemă, am studiat efectele inhibitorului NA oseltamivir carboxilat (OC) (9) asupra intrării virusului gripal în culturile epiteliului căilor respiratorii umane. Celulele epiteliale traheobronchiale umane primare (HTBE; Clonetică) și celulele epiteliale nazale primare (PromoCell GmbH) au fost cultivate pe suporturi de membrană (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) la interfața aer-lichid în factor de creștere fără ser și mediu suplimentat cu hormoni (6, 8). Culturile complet diferențiate de 4 până la 8 săptămâni au fost utilizate pentru toate experimentele. Aceste culturi au fost pseudostratificate și polarizate; conțineau celule bazale, ciliate și secretoare de mucus; și seamănă foarte mult cu epiteliul căilor respiratorii umane in vivo (Fig. 1). OC (1 MMC, dacă nu se indică altfel) a fost adăugat la suspensiile virale și la compartimentele bazolaterale ale culturilor cu puțin timp înainte de infectarea a două culturi replicate din partea apicală. Două culturi de control au fost infectate în absența inhibitorului. La o oră după infectare, am îndepărtat inoculul virusului și am incubat culturile la interfața aer-lichid pentru încă 6 ore pentru a permite replicarea intracelulară a virusului. Culturile au fost apoi fixate, iar celulele infectate au fost identificate prin colorarea cu antiseruri policlonale la virusuri întregi urmate de anticorpi secundari corespunzători marcați cu peroxidază (Dianova) și substrat aminoetilcarbazol (Sigma). Colorarea pozitivă a indicat intrarea cu succes a virusului în celulă. Culturile au fost analizate en față la o mărire de 300 de centimetrii (Olympus IMT-2). Un număr total de celule care exprimă antigenul viral a fost numărat în segmentul epitelial care a inclus toate vizualizările microscopice consecutive (0,28 x 0,42 mm) de-a lungul diametrului culturii (suprafața segmentului, 3 mm2; numărul de celule pe segment, aproximativ 30.000). Patru segmente pe cultură au fost numărate prin rotirea culturii în sensul acelor de ceasornic cu 45o. datele pentru opt segmente din două culturi replicate au fost medii.
în două experimente care au folosit culturi HTBE, virusul uman a/Memphis/14/96 (H1N1) a infectat de 22 și 65 de ori mai puține celule în prezența inhibitorului NA comparativ cu grupurile de control (Fig. 2; Tabelul 1) (P < 0,0001). Virusurile a/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) de la o pasăre acvatică sălbatică și a/Turkey/Italy/2379 / 99 (H7N1) de la păsările domestice au fost, de asemenea, semnificativ sensibile la OC în aceste culturi. În culturile epiteliale nazale, OC a redus infecția cu virusul uman și rață de 120 și, respectiv, de 520 de ori. Aceste rezultate au indicat faptul că inhibarea na virală suprimă inițierea infecției cu virus.
a/Chicken/Germany/R28/03 (H7N7) aparține genealogiei virusului gripei aviare înalt patogene care a provocat izbucnirea ciumei păsărilor în fermele comerciale de păsări din Olanda, Belgia și Germania în 2003. Aceste virusuri au fost transmise la cel puțin 89 de oameni, dintre care majoritatea prezentau conjunctivită, dar a apărut și un caz fatal de pneumonie (5). Infecția cu virusul H7N7 la pui în culturile HTBE a scăzut de 140 și 40 de ori în prezența a 1 și, respectiv, 0,1 oc. Aceste concentrații au reprezentat concentrații plasmatice maxime și minime tipice ale medicamentului obținute la om după administrarea a 75 mg fosfat de oseltamivir, doza recomandată pentru profilaxie (9).
pentru a confirma ipoteza că inhibarea infecției în experimentele noastre a fost direct legată de inhibarea activității enzimatice virale na, am folosit a/Sydney uman/5/97-virusul similar (H3N2) și mutantul său rezistent la oseltamivir cu o substituție R292K în NA, care face NA de 9.000 de ori mai puțin sensibil la inhibarea de către OC (4). În concordanță cu ipoteza, virusul uman părinte a fost puternic inhibat de OC, în timp ce doar un nivel marginal de inhibare a mutantului Rezistent a fost observat atunci când ambii viruși au fost testați în același experiment în culturi HTBE (Tabelul 1). Până în prezent, nu a fost disponibil un test adecvat pe culturi celulare pentru monitorizarea rezistenței virusului gripal la inhibitorii de NA din cauza nepotrivirii dintre receptorii acidului sialic la om și liniile celulare convenționale de laborator (9, 11). Rezultatele noastre sugerează că culturile diferențiate ale epiteliului căilor respiratorii umane pot fi un sistem de cultură celulară adecvat pentru detectarea rezistenței virusului gripal la inhibitorii NA.
în cele din urmă, folosind droguri sensibile a / Sydney/5/97-la fel ca virusul, am testat inhibarea infecției prin OC adăugată la momente diferite după inocularea virusului. În timp ce 47 de ori mai puține celule au fost infectate atunci când medicamentul a fost adăugat cu puțin timp înainte de infecție, o întârziere de 1-h în adăugarea OC a dus la o inhibare de numai 1,5 ori în ceea ce privește controlul netratat (Tabelul 1). Dacă medicamentul a fost adăugat la 4 ore după inocularea virusului, nu s-a observat o inhibare semnificativă statistic. Aceste date au sugerat că OC a afectat primele etape ale infecției care preced replicarea virusului.
în rezumat, am furnizat aici pentru prima dată dovezi experimentale directe pentru rolul esențial al NA în stadiul invaziei virale a epiteliului ciliat al căilor respiratorii umane. Funcția NA în acest stadiu este cel mai probabil îndepărtarea receptorilor de momeală de pe mucine, cili și glicocalix celular, legarea puternică la fiecare dintre acestea ar împiedica accesul virusului la receptorii funcționali de pe membrana de suprafață a celulelor țintă. Cu toate acestea, alte funcții NA—de exemplu, promovarea fuziunii mediate de hemaglutinină (7)-nu pot fi excluse și sunt necesare studii suplimentare pentru a specifica mecanismele exacte prin care NA promovează intrarea virusului în celulele epiteliale ale căilor respiratorii.
fără vaccin disponibil încă împotriva virusurilor gripei aviare înalt patogene H7N7 și H5N1, medicamentele antivirale rămân singura opțiune de combatere a gripei aviare (10). În comparație cu alți agenți antigripali, inhibitorii NA sunt bine tolerați și eficienți împotriva tuturor tulpinilor de virusuri gripale A și B. Au existat puține dovezi ale apariției rezistenței virale, iar infecțiozitatea virusurilor mutante este de obicei compromisă (9, 11). Capacitatea inhibitorilor NA de a suprima infecția înainte de intrarea virusului în celule subliniază potențialul lor ridicat de măsuri preventive. În special, datele noastre oferă baza științifică pentru a sprijini utilizarea profilactică a acestor compuși pentru persoanele cu risc ridicat de infecție cu virusurile gripei aviare.
