scurtă introducere: tehnici de Blotting
Blotting este utilizat în biologia moleculară pentru identificarea proteinelor și acizilor nucleici și este utilizat pe scară largă în scopuri de diagnosticare. Această tehnică imobilizează molecula de interes pe un suport, care este o membrană nitrocelulozică sau nailon. Utilizează tehnici de hibridizare pentru identificarea acizilor nucleici și a genelor specifice.
tehnica blotting este un instrument utilizat în identificarea biomoleculelor, cum ar fi ADN ad, ARNm și proteine în diferite stadii de exprimare a genelor. Sinteza proteinelor implică exprimarea unui segment de ADN care se transformă în ARNm pentru a produce proteina respectivă.
subtipurile de blotting, cum ar fi nordul, vestul & sudul, depind de molecula țintă care este căutată. Când o secvență de ADN este fundamentul sau codul pentru o moleculă de proteină, molecula de ADN particulară de interes poate fi ștearsă folosind tehnica Southern Blotting. În timpul expresiei genelor, când ADN-ul este exprimat ca ARNm pentru o producție de proteine, acest proces poate fi identificat prin blotarea nordică. În cele din urmă, ARNm codificat produce proteina în cauză, această identificare a proteinelor se poate face prin Western Blotting.
procedura generală de ștergere
- omogenizați proba.
- separarea moleculei de interes printr-o membrană de electroforeză.
- transferarea moleculelor într-o membrană nitro-celulozică/ membrană de nailon.
- hibridizarea sau identificarea moleculei
Northern Blotting
Northern Blotting este o tehnică utilizată pentru studiul expresiei genelor. Se face prin detectarea unui anumit ARN (sau ARNm izolat). ARNm este în general reprezentat ca 5% din secvența totală de ARN. Această metodă dezvăluie identitatea, numărul, activitatea și dimensiunea genei particulare. Această tehnică de ștergere poate fi utilizată și pentru creșterea unui țesut sau a unui organism. În diferite etape de diferențiere și morfogeneză, abundența unui ARN se schimbă și acest lucru poate fi identificat folosind această tehnică. De asemenea, ajută la identificarea stării anormale, bolnave sau infectate la nivel molecular. Tehnica northern blot a fost dezvoltată în 1977 de James Alwine, David Kemp și George Stank la Universitatea Stanford. Tehnica și-a luat numele datorită asemănării procesului cu Southern blotting. Diferența principală dintre aceste două tehnici este că Northern blotting se referă doar la ARN.
principiu
ca toate normale blotting tehnica, Northern blotting începe cu electroforeza pentru a separa probele de ARN de dimensiune. Electroforeza separă moleculele de ARN pe baza încărcării acizilor nucleici. Încărcarea în acizii nucleici este proporțională cu dimensiunea secvenței de acid nucleic. Astfel, membrana de electroforeză separă secvența acidului Nucleic în funcție de mărimea secvenței ARN. În cazurile în care secvența noastră țintă este un ARNm, eșantionul poate fi izolat prin oligoceluloză cromatografic tehnici, deoarece ARNm sunt caracterizate de poli(a)-coadă. Deoarece moleculele de gel sunt fragile în natură, secvențele separate sunt transferate pe membranele de nailon. Selecția membranei de nailon este contribuită la factorul că acizii nucleici sunt încărcați negativ în natură. Odată ce moleculele de ARN sunt transferate, acestea sunt imobilizate prin legătură covalentă. Sonda este apoi adăugat, sonda poate fi complementară o secvență de ADN ss. Formamida este utilizată în general ca tampon de ștergere, deoarece reduce temperatura de recoacere.
procedură
- eșantionul de țesut sau cultură colectat este mai întâi omogenizat. Probele pot fi reprezentative pentru diferite tipuri de culturi pentru comparație sau pot fi pentru studiul diferitelor etape de creștere în interiorul culturii.
- secvența ARN este separată în unitatea de electroforeză un gel de agaroză este utilizat în scopul separării acidului nucleic.
- acum secvența de ARN separată este transferată în membrana de nailon. Acest lucru se face prin două mecanisme acțiune capilară și interacțiunea Ionică.
- operația de transfer se face prin păstrarea gelului în următoarea ordine. În primul rând, gelul de agaroză este plasat pe fundul stivei, urmat de membrana blotting. Pe partea de sus a acestor prosoape de hârtie este plasată o greutate ușoară (placă de sticlă). Întreaga configurare este păstrată într-un pahar care conține tampon de transfer.
- ARN transferat pe membrana de nailon este apoi fixat folosind radiații UV.
- membrana fixă de nailon este apoi amestecată cu sonde. Sondele sunt concepute special pentru gena de interes, astfel încât acestea vor hibridiza cu secvențe de ARN pe blotul corespunzător secvenței de interes.
- membrana blot este spălată pentru a îndepărta sonda nedorită
- sonda marcată este detectată prin chemiluminescență sau autoradiografie. Rezultatul va fi benzi întunecate în filmul cu raze X.
GEl și sonde
probele de ARN sunt separate folosind geluri de agaroză folosind formaldehidă ca agenți de denaturare, dar în secvențe mici de ARN sau micro ARN pot fi utilizate și secvențe de poliacrilamidă cu uree ca agent de denaturare. Bromura de etidiu poate fi utilizată ca agent de colorare. Două tipuri de markeri sunt pentru marcarea dimensiunilor. O scară ARN și o subunitate ribozomală sunt utilizate pentru identificarea dimensiunii secvențelor ARN.
sondele pot fi complementare întregului sau unei părți a ARN-ului de interes. Acestea pot fi ARN, ADN sau oligonucleotide de 25 de perechi de bază complementare cu ARN-ul țintă. În cazul sondelor ARN, sondele produse invitro sunt utilizate deoarece sondele invivo se pot denatura datorită spălării riguroase. În cazul ADNc, sondele sunt etichetate cu izotopi radioactivi, fosfatază alcalină sau peroxidază de hrean în caz de chemiluminescență.
