Pata Giemsa: principiu, procedură și rezultate

pata Giemsa este un tip de pată Romanowsky, numit după Gustav Giemsa, un chimist German care a creat o soluție de colorant. Acesta a fost conceput în primul rând pentru demonstrarea paraziților malariali în frotiurile de sânge, dar este, de asemenea, utilizat în histologie pentru examinarea de rutină a frotiului de sânge.

utilizări ale petelor Giemsa

în afară de colorarea paraziților malariali, pata Giemsa are o varietate de aplicații în Microbiologie și patologie:

• pata Giemsa este utilizată pentru a obține un număr diferențial de celule albe din sânge.
• este, de asemenea, utilizat pentru a diferenția morfologia nucleară și citoplasmatică a diferitelor celule sanguine, cum ar fi trombocitele, RBC-urile, WBC-urile.
• în Microbiologie, pata Giemsa este utilizată pentru colorarea corpurilor de incluziune în Chlamydia trachomatis, speciile Borrelia și, dacă pata lui Wayson nu este disponibilă, pentru a pata Yersinia pestis. Giemsa pata, de asemenea, este utilizat pentru a pata Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci, Klebsiella granulomatis, Penicillium marneffei și, ocazional, capsule bacteriene.
• această pată este, de asemenea, utilizată în citogenetică pentru a pata cromozomii și a identifica aberațiile cromozomiale. Acesta este frecvent utilizat pentru G-banding (Giemsa-Banding)

principiul Giemsa Stain

Giemsa stain este o pată diferențială și conține un amestec de colorant azuriu, albastru de metilen și eozină. Este specific pentru grupările fosfat ale ADN-ului și se atașează acolo unde există cantități mari de legare adenină-timină.

azurul și eozina sunt coloranți acizi care colorează variabil componentele de bază ale celulelor, cum ar fi citoplasma, granulele etc.

albastrul de metilen acționează ca colorant bazic, care pătează componentele acide, în special nucleul celulei.

metanolul acționează ca un fixativ, precum și pata celulară. Fixativul nu permite nicio modificare suplimentară a celulelor și le face să adere la diapozitivul de sticlă.

compoziția Giemsa Stain

Giemsa stain poate fi preparată în casă folosind Giemsa stain powder sau poate fi obținută comercial. Ingredientele de bază ale ambelor sunt aceleași; cu toate acestea, diluțiile pot fi făcute în funcție de utilizare.

procedura

A. pentru prepararea internă a petelor:

1. se cântărește cantitatea necesară de pată de pulbere și se transferă într-o sticlă de capacitate curată și uscată de 1 litru. Se adaugă metanol și se amestecă bine.
2. măsurați și adăugați glicerol și amestecați bine.
3. așezați flaconul de pată în baie de apă la 50-60 centi X sau la 37 centi XI X timp de până la 2 ore cu amestecare frecventă.
4. etichetați flaconul și păstrați-l într-un loc răcoros și întunecat, cu un dop ferm.

NOTĂ: Dacă apa intră în contact în timpul oricărei etape de preparare a petelor, pata se deteriorează, prin urmare, utilizați, uscați sticlăria și depozitați în condiții în care nu ar exista contact cu apa.

• se filtrează pata folosind Whatman filterpaper no. 1 și se diluează cu apă tamponată la pH 7.2 pentru a face soluții de lucru

B. Pentru colorarea lamelelor

metoda de colorare, concentrare și sincronizare a petelor utilizate variază în funcție de scop, de exemplu, frotiurile subțiri de sânge utilizează diluția stocului 1:20, în timp ce pentru frotiul gros de sânge se utilizează diluția 1:50.

frotiu de sânge subțire

1. fixați pelicula uscată la aer în metanol absolut prin înmuierea scurtă a peliculei (două picături) într-un borcan de Coplină care conține metanol absolut.
2. scoateți și lăsați să se usuce la aer.
3. pată cu pată Giemsa diluată (1:20, vol/vol) timp de 20 min (pentru 1:20 diluție, se adaugă 2 ml de stoc Giemsa la 40 ml de apă tamponată într-un borcan Coplin).
4. spălați prin scufundarea scurtă a toboganului într-un borcan Coplin cu apă tamponată (una sau două scufundări).
   notă: spălarea excesivă va decolora filmul.
5. lăsați aerul să se usuce în poziție verticală. Observați sub microscop mai întâi la 40x și apoi folosind lentile de imersie în ulei

frotiuri groase de sânge

1. lăsați filmul să se usuce bine la aer timp de câteva ore sau peste noapte. Nu uscați filmele într-un incubator sau prin căldură, deoarece acest lucru va fixa sângele și va interfera cu lizarea RBC-urilor.
   Notă: Dacă este necesar un diagnostic rapid de malarie, filmele groase pot fi făcute puțin mai subțiri decât de obicei, lăsate să se usuce timp de 1 oră și apoi colorate.
2. NU REPARA.
3. pată cu pată Giemsa diluată (1:50, vol/vol) timp de 50 min (pentru o diluție de 1:50, se adaugă 1 ml de stoc Giemsa la 50 ml de apă tamponată într-un borcan Coplin)
4. se spală prin plasarea filmului în apă tamponată timp de 3 până la 5 min.
5. lăsați aerul să se usuce în poziție verticală și observați la microscop mai întâi la 40x și apoi folosind lentile de imersie în ulei

pentru Chlamydia trachomatis

urmați pașii menționați mai sus, dar cu pata diluată de diluție 1:40 (adăugați 0,5 ml soluție stoc Giemsa la 19,5 ml apă tamponată) și lăsați pata timp de 90-120 minute.

observație:

la observarea microscopică, organele celulare, bacteriile și paraziții se disting în funcție de morfologia și culoarea lor;