PMC

1 protocoalele detaliate și sfaturile de depanare pentru toate aspectele sistemului de expresie a proteinelor de fuziune genetică GST sunt disponibile de la GE Healthcare în manualele: sistemul de fuziune genetică GST, numărul produsului 18-1157-58 și manualul proteinei recombinante, numărul produsului 18-1142-75. Manualele sunt disponibile pentru achiziționare pe suport de hârtie sau pot fi accesate în format PDF pe site-ul GE Healthcare.

2se recomandă utilizarea jm105 sau a unei tulpini similare pentru clonarea și întreținerea vectorului. Tulpinile de BL21 și derivații săi, sau o altă tulpină cu deficit de protează, sunt recomandate pentru exprimarea maximă a proteinelor. Tulpinile deficitare în produsele genei proteazei citoplasmatice, cum ar fi lon, ompT, degP sau htpR, pot minimiza efectele degradării proteolitice a proteinei supraexprimate de către gazdă. Nu utilizați o tulpină de E. coli care poartă alela rec1A pentru a propaga plasmidele pGEX, deoarece au fost raportate ștergeri sau rearanjări ale ADN-ului plasmidic.

3glutation Sepharose 4B mass-media în vrac este utilizat în acest protocol de purificare. Acest mediu de cromatografie este ideal pentru condiții de screening și permite o scară ușoară. Purificările sunt efectuate cu ușurință folosind fie fluxul gravitațional, fie un sistem de cromatografie de joasă presiune, sau pot fi utilizate în purificări de lot bazate pe centrifugare. Coloanele de afinitate GSTrap FF sunt coloane preambalate de 1 ml sau 5 ml, care sunt, de asemenea, disponibile și pot fi conectate în serie pentru scalare. Aceste coloane sunt destinate utilizării cu un sistem cromatografic lichid, o pompă sau o seringă. În plus față de aceste formate, glutation Sepharose, de asemenea, este disponibil în coloane de spin și formate de plăci de 96 de bine pentru screening-ul rapid al expresiei proteinelor de fuziune GST și condiții de purificare.

4dfp este o neurotoxină extrem de periculoasă. Respectați măsurile de precauție furnizate de producător și manipulați reactivul îngrijit numai într-o hotă chimică de fum.

5adăugarea inhibitorilor de protează la tamponul de liză va ajuta la prevenirea degradării proteolitice a proteinei țintă în timpul extracției. Cu toate acestea, cocktailul exact de inhibitori de protează adăugați la tamponul de liză trebuie adaptat la caracteristicile proteinei țintă. Agenții reducători precum 2-ME, DTT sau TCEP la concentrații de 1-10 mM trebuie adăugați la tampon, după cum este necesar. Adăugarea unui detergent neionic, cum ar fi 1% Triton X-100, de asemenea, pot fi adăugate la tampon pentru a ajuta la extracție.

6următorul este un protocol de screening pentru a verifica nivelurile de expresie a proteinelor de fuziune în mini-culturi. Prezența unei creșteri a nivelului de proteine la greutatea moleculară așteptată pe un gel SDS-PAGE după inducerea cu IPTG este un bun indiciu al expresiei proteice de succes. După inducție, ar trebui să fie vizibilă o bandă proeminentă la greutatea moleculară așteptată (greutatea moleculară a proteinei țintă + ~ 26 KDa pentru partea GST). Dacă se suspectează că proteina este exprimată la un nivel scăzut, verificarea expresiei corecte poate fi realizată folosind Western blotting cu un anticorp specific fie pentru proteina țintă, fie pentru GST. În cazul în care probele nu vor fi analizate imediat prin SDS-PAGE, acestea pot fi depozitate peste noapte la 4 centimetrii C sau la -20 centimetrii C pentru depozitare pe termen lung.

1. se inoculează mai multe colonii izolate în tuburi separate de centrifugă de 50 ml conținând 10 ml LB suplimentate cu 100 hectolitri/ml ampicilină. Creșteți o cultură peste noapte la 37 C cu agitare.

2. a doua zi dimineață, se adaugă 0,5 ml cultură peste noapte la 4,5 ml LB cu 100 hectolitri/ml ampicilină. Grow 1 h la 37 C.

3. se îndepărtează 1 ml de probă neindusă. Centrifugați și îndepărtați supernatantul. Congelați sau depozitați pe gheață până când sunteți gata să rulați pagina SDS.

4. adăugați IPTG la o concentrație finală de 1 mM și creșteți pentru încă 2-3 ore.

5. se îndepărtează proba indusă de 1 ml. Centrifugați și îndepărtați supernatantul. Congelați sau depozitați pe gheață până când sunteți gata să rulați pagina SDS.

6. omogenizați peletele celulare în tampon de probă de 200 unktql SDS-PAGE; se încălzește 3-5 min la 90 untct C.

7. Analizeaza 5-10 unktil folosind SDS-Pagina urmată de colorarea albastru Coomassie (sau 1-2 unktil pentru Western blot).

7 eșantioanele cultivate în mini-culturi pot fi, de asemenea, utilizate pentru a evalua solubilitatea unei anumite proteine de fuziune (a se vedea nota 6 pentru protocolul de exprimare a mini-culturii). La sfârșitul perioadei de inducție, recoltați celulele prin centrifugare. Omogenizați peleta în 200 unqql de PBS rece. Lyse celulele folosind Sonicare; păstrați proba pe gheață. Salvați o mică alicotă a lizatului pentru analiză prin SDS-PAGE. Centrifugați proba lizată timp de 15 min. Scoateți supernatantul într-un tub separat. Omogenizați peleta în 200 unqql PBS. Analiza o parte din lizat brut, supernatant, și pelete omogenizate prin SDS-PAGE sau Western blotting. Dacă eșantionul este observat atât în fracția lizată, cât și în fracția supernatantă, eșantionul este solubil în mod adecvat. Dacă eșantionul este prezent în principal în lizatul și peleta omogenizată, eșantionul este cel mai probabil în corpurile de ocluzie. În cazurile în care proteina este localizată în corpuri de incluziune, explorați diferite condiții de Expresie pentru a schimba expresia într-o formă solubilă (a se vedea nota 8).

8dacă proteina de fuziune este exprimată în principal în corpuri de incluziune (de ex. >80% insolubil), pot fi utilizate diferite strategii pentru a îmbunătăți solubilitatea. Adesea, inducția la o temperatură mai scăzută (15-25 C) este eficientă la trecerea expresiei de la corpurile de incluziune la fracția solubilă. Celulele induse la această temperatură mai scăzută vor crește mai lent și vor necesita perioade de inducție peste noapte. În unele cazuri, poate fi necesară utilizarea unor tulpini alternative de gazdă sau modificări ale construcției plasmidice. Dacă proteina de fuziune rămâne în primul rând în corpurile de incluziune chiar și după încercările de a obține proteine solubile, poate fi utilă extinderea producției de E. coli și purificați suficientă proteină din cantitatea mică de proteine solubile care este disponibilă. În unele cazuri, ar trebui explorate alte etichete de proteine de fuziune.

9 nivelurile scăzute de expresie a proteinelor ar putea fi rezultatul utilizării rare a codonilor. În acest caz, trecerea la o altă tulpină de E. coli care conține transcrieri suplimentare pentru Arnt codon rar poate îmbunătăți semnificativ producția de proteine. Diferite formulări media sau adăugarea de până 2% glucoză, de asemenea, poate îmbunătăți expresia (13, 14). Dacă se suspectează că proteina exprimată este toxică pentru celule (de obicei, acestea vor înceta să crească după inducerea cu IPTG), încercați să induceți la un moment ulterior pentru o perioadă mai scurtă de timp. Scăderea concentrației IPTG este o altă opțiune care ar trebui explorată.

10creșterea celulară monitorizată prin citirea densității optice la 600 nm (A600). O cultură peste noapte ar trebui să ajungă la un A600 ~1-1.2. Celulele trebuie induse într-o fază timpurie a curbei de creștere logaritmică pentru E. coli, A600 ~ 0,5 până la 0,7. La 37 C, va dura aproximativ 2 ore pentru ca culturile să ajungă la un stadiu timpuriu de creștere. Dacă celulele sunt cultivate la o temperatură mai scăzută, timpul de incubație trebuie crescut, deoarece celulele vor crește mai lent la temperaturi mai scăzute. În general, cel mai mare randament de proteine de fuziune va fi obținut atunci când celulele sunt induse la A600 = ~ 0,5. După inducerea cu IPTG, o orientare generală pentru timpul de incubație este următoarea: 3 h la 37 XCT, 5 h la 30 XCT și peste noapte pentru 25 XCT sau mai puțin. Recoltați celulele înainte de saturație, A600 ~ 1.0–1.2.

11pentru a asigura o aerare adecvată, baloanele trebuie umplute numai la 20-30% din capacitatea lor.

12este important să nu fie prezenți inhibitori de serin-protează în probă înainte de scindarea cu trombină sau factor Xa. Următorii inhibitori de protează trebuie eliminați înainte de clivarea trombinei sau a factorului Xa: AEBSF, APMSF, antitrombina III, antipaină, antitripsină, aprotinină, chimostatină, hirudină, leupeptină și PMSF. În plus, pefabloc TH benzamidine este specific pentru trombină, iar pefabloc FXa este specific factorului Xa. Următorii inhibitori de protează trebuie evitați în cazul proteazei de Prescisiune: 100 mM ZnCl2, 100 cmctatină și 4 mm Pefabloc.

13există o serie de metode alternative pentru detectarea proteinelor de fuziune GST. Pentru proteinele care se exprimă bine la un nivel ridicat, cea mai simplă metodă de monitorizare a purificării este prin geluri SDS-PAGE colorate cu pată albastră sau argintie coomassie. O alternativă pentru proteinele care se exprimă la niveluri scăzute este utilizarea Western blotting folosind un anticorp direcționat fie către GST, fie către proteina țintă. O alternativă pentru expresiile la scară mică este monitorizarea prezenței GST cu un test de enzimă ELISA sau CDNB.

14salvați o cantitate mică de probă de proteine din fiecare etapă a purificării, inclusiv Liza, supernatantul, peletele, fracțiile nelegate din încărcarea eșantionului, etapele de spălare și etapele de eluție pentru a fi analizate prin SDS-PAGE sau Western blotting. După ce toate probele au fost analizate și reunite, aruncați fracțiile nedorite.

15gst proteine, de asemenea, pot fi purificate folosind o metodă de purificare lot. O metodă de purificare a lotului este rapidă, ușoară și necesită puțin echipament; cu toate acestea, proteina rezultată poate conține mai multe impurități și poate avea un randament mai mic decât o purificare bazată pe cromatografie. Lot purificări sunt utilizate cel mai bine atunci când condițiile de purificare de screening. Purificarea lotului prezentată mai jos se efectuează în general la temperatura camerei. Pentru a minimiza riscul de degradare proteolitică, procedura poate fi efectuată la 4 centi C prin creșterea timpului de incubație de 2 până la 4 ori.

1. și de a obține proteine de fuziune solubile (a se vedea notele 8 și 21 dacă proba este în corpurile de incluziune).

2. se adaugă 2 ml 50% suspensie glutation Sepharose vrac matrix (1 ml pat volum) per 100 ml bacterian lizat supernatant. Se incubează 30 min la temperatura camerei cu agitare ușoară.

3. centrifugă 500 g pentru 5 min. Scoateți supernatantul și salvați pentru analiză prin SDS-PAGE pentru a determina eficiența legării.

4. spălați rășina cu 10 volume de pat PBS. Omogenizați ușor suspensia și apoi centrifugați 500 de grame la sută timp de 5 min. Scoateți supernatantul. Repetați pașii de spălare și centrifugare pentru un total de 3 spălări a câte 10 volume de pat fiecare.

5. Eluați proteina de fuziune prin omogenizarea rășinii cu 1,0 ml tampon de eluare a glutationului per ml volum de pat. Incubați 10 min la temperatura camerei. Centrifugă 500 g pentru 5 min. Transferați supernatantul care conține proteine de fuziune într-un tub separat. Repetați pașii de eluție și colectare în total de 3 ori. Supernatanții pot fi grupați sau analizați separat de SDS-PAGE pentru a monitoriza conținutul de proteine (Vezi nota 12).

volumul patului 16A este egal cu jumătate din suspensia de 50% de glutation Sepharose 4b utilizată pentru purificare. Pentru a prepara o suspensie de 50% de Sepharose glutation (este furnizat ca ~ 75% suspensie): determinați volumul de pat necesar pentru scara de purificare. Omogenizați sepharoza de glutation 4B. pentru fiecare ml de volum de pat necesar, pipetați 1,33 ml din suspensia de 75% într-un tub de centrifugă de dimensiuni adecvate. Centrifuga la 500 de grame pentru 5 min. Decantează super. Se spală cu 10 volume de pat (10 ml per 1,33 ml suspensie originală) de PBS prin răsturnarea ușoară a tubului de mai multe ori pentru a se amesteca, apoi se centrifughează 500 de grame de 5 min. Decantează super. Eșecul îndepărtării soluției de stocare a etanolului poate interfera cu etapele ulterioare de legare. Se adaugă 1 ml PBS pentru fiecare 1,33 ml din suspensia originală. Aceasta are ca rezultat o suspensie de 50%.

17glutationul Sepharose are o capacitate minimă de legare anunțată de 8 mg/ml. O coloană de 20 ml trebuie să fie adecvată pentru purificarea proteinelor din 3 culturi de E. coli de 600 ml, care conțin ~ 20-40 mg proteină de fuziune per cultură. Atât cantitatea de rășină utilizată, cât și dimensiunea coloanei pot fi scalate în sus sau în jos, în funcție de cantitatea de proteine care trebuie purificată.

18resuspendați peleta utilizând un tampon de spălare de 25-50 unkticl per ml cultură originală.

19 perturbarea celulelor este completă atunci când suspensia se șterge parțial și devine o culoare ușor mai închisă. Evitați spumarea în timpul Sonicare, deoarece acest lucru poate duce la denaturarea proteinei de fuziune. Evitați suprasolicitarea, deoarece acest lucru poate duce la co-purificarea proteinelor gazdă E. coli împreună cu proteina de fuziune GST. Vâscozitatea ridicată datorată eliberării acizilor nucleici în timpul sonicării poate fi redusă prin adăugarea de Dnază sau benzoză la tamponul de liză. Lizozim până la o concentrație de 0.2 mg / ml pot fi adăugate ca ajutor pentru liza celulară. O alternativă la Sonicare este utilizarea formulărilor de extracție a celulelor disponibile în comerț. Cu toate acestea, aceste produse ar putea conține componente brevetate care interferează cu aplicațiile din aval.

20dacă încercările de a schimba expresia de la corpurile de incluziune la fracția solubilă eșuează, proteinele de fuziune GST insolubile pot fi uneori purificate în prezența denaturanților, cum ar fi ureea, urmată de refolding. Solubilizarea folosind detergenți precum sarkosyl (n-laurylsarosine) a fost, de asemenea, utilizată cu succes (15, 16). Deși următorul protocol a fost utilizat cu succes pentru a denatura și re-naturaliza proteinele de fuziune GST, fiecare construcție de proteine de fuziune este unică și condițiile exacte de denaturare și re-naturare trebuie determinate empiric. Denaturanții obișnuiți care au fost utilizați cu succes includ Guanidina HCl, ureea, Tween 20, CTAB și SDS (17, 18). Denaturanții trebuie apoi îndepărtați complet pentru a permite reumplerea corectă a proteinei. Condițiile care ar trebui optimizate pentru a facilita refoldarea includ: tipul de denaturant, pH, prezența agentului reducător, viteza de îndepărtare a denaturantului și concentrația de proteine. Odată ce proteina a fost Re-naturală, verificați dacă proteina și-a recăpătat conformația și funcția nativă și îndepărtați orice proteină pliată necorespunzător.

1. preechilibrați coloana de Sepharoză a glutationului; sonicați celulele E. coli granulate și separați fracțiile supernatantului lizat și fracțiile de Peleți prin centrifugare (vezi 3.3 purificarea prin afinitate a proteinei de fuziune GST etapele 1-8). Omogenizați peleta de lizat care include corpurile de incluziune, în 15 ml tampon de spălare. Centrifugă 20 min la 48.000 XT (4 XT). Se decantează supernatantul și se omogenizează peleta spălată în 12 ml u-tampon (se omogenizează în 20 U-tampon u-tampon per ml din cultura originală). Incubați 2 ore pe gheață.

2. centrifugă 20 min la 48.000 XT (4 XT). Transferați supernatantul care conține proteina de fuziune denaturată într-un tub de centrifugă curat.

3. se adaugă Triton X-100 la supernatant la o concentrație finală de 1%.

4. dializați proba în PBS / glicerol timp de 2-3 ore. volumul tamponului de dializă trebuie să fie de cel puțin 20 de ori mai mare decât volumul probei.

5. dializați eșantionul peste noapte față de PBS cu inhibitori de protează utilizând un volum tampon >de 100 de ori volumul eșantionului.

6. se scoate proba din dializă și se centrifughează 20 min la 4.000 g.

7. proteina extrasă și re-naturală din corpurile de incluziune poate fi aplicată acum pe coloanele Sepharose de glutation și purificată.

soluții:

soluție tampon de Spălare: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mm PMSF, pH 8.0

U tampon: 5 M uree, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-M, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8.0

PBS/glicerol: 1X PBS, 20% glicerol, 1% Triton X-100, 5 mM 2-5 mM EDTA, 5 mM 2 – M, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use de o pompă peristaltică este sfătuit să-și uniform de control al debitului. Dacă apare compresia rășinii, presiunea este prea mare și debitul trebuie redus.

22cinetica de legare între glutation și GST este relativ lentă. Prin urmare, este important să se utilizeze debite mici pentru a obține o capacitate maximă de legare, de exemplu 0,1 ml/min pentru o coloană I. D. de 2,5 cm. Utilizarea debitelor prea rapide poate reduce cantitatea de proteine de fuziune legate datorită cineticii lente a asocierii. Etapele de spălare și eluare pot fi efectuate la debite mai rapide pentru a economisi timp (1,5 ml/min și, respectiv, 0,3 ml/min). Pentru eșantioanele cu volum mare, legarea este efectuată cel mai convenabil peste noapte, cu ajustări ale debitelor, astfel încât coloana să nu se usuce.

23analiza fracțiilor nelegate va indica dacă proteina de fuziune se leagă sau nu. Dacă proteina nu este detectată în fracțiile timpurii, dar apare în fracțiile ulterioare, aceasta indică faptul că capacitatea coloanei a fost depășită. Reducerea încărcăturii proteice sau creșterea dimensiunii coloanei va atenua această afecțiune.

24dacă proteina de fuziune se leagă slab de sepharoza glutationului, există mai multe alternative pentru a încerca creșterea eficienței de legare. Încercați o metodă de liză mai blândă. Dacă metoda utilizată este prea dură, proteina poate deveni denaturată și, prin urmare, incapabilă să se lege de coloană. De asemenea, în cazul re-naturizării proteinei din corpurile de incluziune, asigurați-vă că toți denaturanții au fost îndepărtați din tampon, fie prin dializă exhaustivă, fie prin aplicarea probei pe o coloană de desalinizare, înainte de aplicarea pe coloana de glutation. Îndepărtați soluția de stocare a etanolului din sepharoza glutationului; reduceți coloana cu tampon de glutation proaspăt urmat de o spălare cu PBS imediat înainte de încărcarea probei. Creșteți cantitatea de rășină și / sau reduceți debitul utilizat pentru încărcarea eșantionului. Încercați să adăugați 1-20 mm DTT la eșantion. Dacă o problemă persistă, curățați coloana conform recomandărilor producătorului. Dacă legarea încă nu este restabilită, încercați să utilizați rășină proaspătă.

25de asemenea, randamentul proteinei de fuziune poate fi estimat prin măsurarea absorbanței la 280 nm (A280). Coeficientul de extincție numai pentru partea GST este ~ 1,5, adică 1,00 A280 = ~ 0.6 mg / ml proteină, deși coeficientul de extincție pentru proteina de fuziune va depinde parțial de caracteristicile de absorbție ale proteinei țintă.

26dacă există o problemă la eluarea proteinei din coloana Sepharose glutation, încercați să reduceți debitul și să creșteți volumul tamponului de eluție utilizat. Asigurați-vă că utilizați tampon de glutation redus proaspăt (faceți-l în ziua în care va fi folosit). Creșteți concentrația de glutation până la 40 mM și/sau creșteți pH–ul tamponului la pH 8,0-9,0. Adăugați 1-20 mM DTT (sau alt agent reducător) la tampon. Adăugarea unui detergent neionic poate îmbunătăți solubilizarea și reduce la minimum orice agregare care poate apărea.

27contaminarea proteinei de fuziune purificată cu proteine de celule gazdă E. coli este un indiciu că Sonicare a fost prea severă. Dacă sunt prezente fragmente degradate ale proteinei de fuziune, încercați să adăugați inhibitori de protează suplimentari la tamponul de liză. Păstrați toate probele, tampoanele și tuburile de colectare la rece pentru a minimiza proteoliza. Dacă degradarea are loc în timpul exprimării proteinelor, încercați să induceți proba târziu (~0.8 OD600) și reducerea duratei perioadei de inducție. Trecerea la o tulpină gazdă alternativă, de asemenea, poate ajuta.

28O alternativă la digestia în soluție este scindarea proteazei proteinei de fuziune în timp ce este legată de matricea Sefarozei glutationului. Proteina de fuziune este extrasă și încărcată pe sepharoza glutationului urmată de spălarea cu PBS (vezi purificarea prin afinitate a proteinei de fuziune GST, etapele 1-11). În loc să elueze proteina cu tampon de glutation, o soluție de PBS care conține enzima este încărcată pe coloană și incubată timp de câteva ore la temperatura camerei (4 CTC pentru proteaza de Prescisiune). Proteina scindată este apoi spălată din coloană cu mai multe volume de coloane de PBS. Proteina de fuziune reziduală și partea GST pot fi îndepărtate din coloană prin spălarea coloanei cu tampon redus de glutation. Cantitatea de enzimă și timpul de incubație trebuie determinate empiric pentru fiecare proteină de fuziune. Analizați toate probele prin SDS-PAGE pentru a determina eficiența clivajului și puritatea proteinelor.

29într–un clivaj de protează în modul lot, adăugați o cantitate determinată empiric de enzimă la proteina de fuziune legată de rășină (a se vedea nota 15 A-d). Utilizați 1 ml de enzimă care conține PBS pe ml de volum de pat. Se incubează la temperatura camerei timp de câteva ore cu agitare ușoară. Se centrifughează 500 g pentru 5 min pentru sedimentarea rășinii. Îndepărtați super-ul care conține proteina țintă într-un tub separat. Spălați sepharoza de glutation cu PBS de până la 3 ori pentru a recupera proteina de fuziune scindată. Incubați rășina cu tampon de glutation pentru a elimina GST și proteina de fuziune reziduală. Utilizați 1 ml tampon de glutation per ml de rășină. Se centrifughează 500 g și se recuperează GST eluat. Repetați de până la 3 ori. Analizați eșantioanele după pagina SDS.

30dacă se utilizează protează de trombină, digestia poate fi efectuată în tamponul de glutation utilizat pentru a Eluta proteina din coloană. Dacă se utilizează factorul Xa, se recomandă dializarea proteinei fie într-un tampon Tris, fie într-un tampon PBS înainte de digestie; glutationul prezent în tamponul de eluție poate perturba punțile disulfidice prezente în factorul Xa, ducând la digestia ineficientă a proteinelor de fuziune. O determinare empirică a condițiilor de digestie pentru fiecare proteină de fuziune trebuie determinată într-un experiment pilot de digestie. O metodă convenabilă este de a digera 100 de grame de proteine de fuziune într-o gamă de raporturi enzimă-substrat și de a varia timpul de incubație. Timpii tipici de incubație variază de la 2 la 8 ore. Rapoartele enzimă-substrat recomandate pentru trombină sunt 1:100, 1:350, 1:1000, și 1:3000 (unități de enzimă pe µg de proteină de fuziune), și de factor Xa sunt 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µg enzimă pe µg de proteină de fuziune). La punctele de timp dorite, îndepărtați 2 unqq de proteine și opriți digestia adăugând alicota probei la tamponul de probă SDS care fierbe. Analizați probele prin pagina SDS pentru a determina condițiile optime de scindare. În plus față de raportul enzimă-substrat și timp, luați în considerare modificarea condițiilor tampon, cum ar fi creșterea sau scăderea concentrației de NaCl sau adăugarea Ca2+ la tampon (consultați nota 31 pentru sfaturi de depanare).

31dacă pe pagina SDS sunt observate mai multe benzi pentru proteina țintă după digestie, verificați secvența de proteine țintă pentru potențiale site-uri secundare de recunoaștere a proteazelor. Dacă există site-uri secundare de clivaj, re-clonați într-un vector diferit. Dacă nu se observă clivaj, verificați secvența ADN pentru a verifica prezența și integritatea locului de clivaj așteptat al proteazei. Asigurați-vă că inhibitorii de protează au fost îndepărtați complet din tampon. Adăugați mai multă enzimă și / sau creșteți timpii de incubație peste noapte. Dacă digestia rămâne incompletă la cele mai mari rapoarte enzimă-substrat și la cele mai lungi momente de timp, luați în considerare reengineerarea locului de clivaj al proteazei pentru a include mai multe Glicine între partea GST și proteina țintă pentru a reduce probabilitatea ca obstacolul steric să interfereze cu clivajul (19, 20).

32dacă inhibarea enzimei după terminarea digestiei folosind inhibitori de serin-protează nu este de dorit, proba poate fi aplicată pe o coloană de Benzamidină HiTrap pentru a îndepărta enzima din probă.

33dacă eșantionul trebuie re-cromatografiat pe coloana Sepharose glutation pentru a elimina GST și orice proteină de fuziune nedigerată, este esențial ca glutationul redus să fie îndepărtat complet din eșantion. Glutationul se echilibrează foarte lent în membranele de dializă; prin urmare, dacă se utilizează tuburi de dializă cu un MWCO <12000, pot fi necesare 3 sau mai multe modificări ale tamponului pentru îndepărtarea completă. Creșterea timpului de dializă (peste noapte) și un volum mai mare de tampon pot fi, de asemenea, necesare pentru volume mari de probe.

34aceeași coloană de Sepharoză glutation poate fi utilizată atât pentru izolarea inițială a proteinei de fuziune, cât și pentru repurificare după clivajul enzimatic. Se recomandă să se dedice o singură coloană unui construct proteic individual pentru a evita contaminarea încrucișată potențială a diferitelor proteine recombinante. Coloanele pot fi reutilizate de mai multe ori. Dacă eficiența legării scade în timp, curățați coloana conform recomandărilor producătorului. Dacă activitatea de legare nu este restabilită, trebuie utilizată o nouă coloană.

35legarea maximă are loc dacă coloana este complet redusă; cu toate acestea, dacă coloana Sepharose glutation a fost spălată cu mai puțin de 48 de ore înainte de această etapă, această etapă poate fi omisă.

36proteina țintă va fi în fracția nelegată, iar GST și orice proteină de fuziune ne-clivată se vor lega de coloană.

37sunt recomandate volume mici de probe pentru o bună rezoluție a proteinei țintă față de alți contaminanți. Dacă nu este posibilă concentrarea probei într-un volum mic, se pot efectua injecții multiple ale probei.