PMC

CPV-2 este principalul agent etiologic al gastroenteritei virale la câini. Este membru al familiei Parvoviridae, aparținând genului protoparvovirus și speciilor de Protoparvovirus de tip 1. Este un virus ne-învelit cu un genom ADN unic catenar, carecoduri pentru două proteine capsidice, VP1 și VP2, necesare pentru asamblarea și ambalarea genomului viral, precum și pentru proteinele nonstructurale NS1 și NS2, careaid în controlul replicării ADN-ului, asamblarea și reglarea expresiei genelor .

în ultimii ani, CPV-2 a dezvoltat noi variante antigenice. În 1980, tulpina originală CPV-2 a fost înlocuită cu varianta desemnată tip 2a (CPV-2A), în 1984 , CPV-2b a fost identificat, iar în 2001, CPV-2C a fost detectat și raportat în Italia. Ultima variantă a fost, de asemenea, identificatăîn Asia, Africa și America. Datorită existenței mai multor variante antigenice pentru CPV-2, semnele clinice pot varia foarte mult .Ulterior, medicii veterinari au mai puțină certitudine atunci când își emit diagnosticul prezuntiv și, de obicei, sunt necesare unele teste de laborator pentru a confirma diagnosticul lor; deși au fost dezvoltate mai multe tehnici în laboratoarele de cercetare, cum ar fi testele de hemaglutinare, imunofluorescența, ELISA, PCR,testul de imunocromatografie și cultura celulară (printre altele), de fapt tehnici cu cea mai mare disponibilitate în laboratoarele clinice din spitalele veterinarenumai testul de imunocromatografie și PCR, cu toate acestea, în cercetarea despre sensibilitatea și specificitatea acestor proceduri, rapoartele sunt controversate.Mai mult, la pacienții cu grade diferite de severitate a bolii, sensibilitatea și specificitatea acestor tehnici nu au fost studiate pe larg.

Obiectivul acestui studiu este de a raporta avantajele și dezavantajele oferite de testul imunocromatografic și PCR pentru diagnosticul pacienților care prezintă o mare diversitate de semne clinice pentru CPV-2.

acest studiu a fost realizat în conformitate cu liniile directoare ale cercetării experimentale pe animale mexicane Nom-062-ZOO-1999.

câinii cu enterită clinică internați în spitalul veterinar pentru animale mici din cadrul Universidad Autectinctoma de Estado de M Inktixico, au fost examinați pentru acest studiu și selectați pe baza CPV-2 testat pozitiv sau negativ folosind PCR imbricat (nPCR). Ca rezultat, au fost selectați 45 de câini care au fost testați pozitiv și 5 câini testați negativ au fost incluși ca controale. Cei 50 de câini au fost examinați clinic de trei medici veterinari simultan pentru a obține sensibilitatea diagnosticului clinic. Fiecare veterinar și-a emis diagnosticul prezumtiv într-o manieră discretă, folosind dosarul medical veterinar orientat spre probleme (POVMR) ca instrument de diagnosticare.

apoi, probele fecale ale tuturor câinilor au fost analizate prin PCR și testul imunocromatografic, în timp ce probele de sânge au fost utilizate pentru a efectua un număr complet de sânge.

nPCR este considerată o tehnică extrem de fiabilă și sensibilă pentru identificarea particulelor virale CPV-2 și , prin urmare, în acest studiu, sensibilitatea testelor utilizate a fost corelată cu cele obținute anterior din nPCR, pentru diagnosticul CPV-2.

probele de scaun de câine au fost obținute cu ajutorul tampoanelor rectale, care au fost suspendate în apă fără nucleaze și 200 unqql de omogenați, și au fost utilizate pentru extracția ADN. Procedura s-a efectuat cu ajutorul kitului de extragere a ADN-ului din scaun qiaamp (QIAGEN, Mainz, Germania), urmând instrucțiunile producătorului. Probele AllDNA au fost cuantificate folosind un spectrofotometru Quawell Q5000 (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, S. U. A.). 100 ng de ADN din fiecare eșantionau fost utilizate pentru reacțiile PCR cu 50 ecql din volumul final. Anterior, o pereche de primeri a fost proiectată în laboratorul nostru pentru a amplifica un fragment de 275 bp,ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) și ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTTAATGCAGTTA-3′) Situat la nucleotidele 1,107–1,130 și 1,360–1,382 din gena VP2 (Numărul GenBankaccession fj0051962c).

reacțiile PCR s-au efectuat folosind 2 ilqq din fiecare primer (200 nM), 12,5 ilqq din GoTaq LQQ Green Master Mix (Promega, Madison, WI,S. U. A.) conținând ADN polimerază, tampon de reacție (pH 8,5) și 400 ilqqm din fiecare nucleotidă (dATP, dGTP, Dctp și dTTP); 3 mM de MgCl2.și 28.5 unqql de apă fără nucleaze. Toate reacțiile s-au efectuat în următoarele condiții de amplificare; 1 ciclu la 94 XCT pentru 5 min denaturare inițială, urmat de 35 de cicluri la 94 XCT pentru 30 sec, 52 XCT pentru 1 min, 72 XCT pentru 1 min și un ciclu final de prelungire la 72 XCT pentru 5 min.

nPCR a fost inițial realizat amplificând un fragment de 1.740 bp folosind primeri ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) și ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC-3′) și au fost proiectați folosind secvențele de nucleotide 1-20 și 1.712–1.740 din gena VP2 pentru câini parvovirus (numărul de aderare GenBank fj0051962c). Reacția a foststandardizată la un volum final de 50 ect.

reacția se amestecă conținute 1 µl de GoTaq® Flexi ADN Polimeraza 5 U/µl (Promega), 5 µl de GoTaq® Flexi tampon 5XGreen, 3 ľl MgCl2 25 mM, 4 µl dNTP 200 µM, 2 µl de primeri, 10 µl de ADN cu o concentrație finală de 100 ng și 23 µl de nuclează de apă gratuită. Reacția s-a efectuat în următoarele condiții de amplificare: 1 ciclu la 94 CT pentru 5 min, urmat de 35 cicluri la 94 CT pentru 30 sec, 50 CT pentru 45 sec, 72 CT pentru 1 min și 1 ciclu la 72 CT pentru 5 min. Ulterior, 1 unqql din produsul acestei reacții a fost utilizat ca șablon ADN pentru procedura de cuibărire, iar grundurile și condițiile de eșantionare au fost aceleași pentru fragmentul de 275 bp.

toate produsele de amplificare au fost identificate prin electroforeză orizontală în geluri de agaroză 2% colorate cu bromură de etidiu de 0,5 MMG/ml și vizualizate cu un transiluminator UV.

pentru analiza testului de imunocromatografie pentru parvovirusul canin (CPV Ag), kitul anigen (bionote Inc., Gyeonggi-do, Coreea) a fost utilizat. Fiecare test a fost efectuat urmând instrucțiunile producătorului.

probele de sânge au fost prelevate din vena jugulară folosind tuburi vacutainer cu EDTA ca anticoagulant. Numărul complet de celule sanguine (CBC) a fost efectuat utilizând contorul de celule anautomatizate (QBC Vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, EU, S. U. A.). Filmele de sânge au fost colorate cu Wright-Giemsa și examinate sub un microscop fotonic. Leucopenia a fost luată în considerare atunci când un număr total de CBC a fost mai mic de 6 xtot 103/xtotl .

analiza rezultatelor a fost realizată prin utilizarea unei matrice pentru variabile codificate și au fost create tabele de contingență pentru a determina proprietățile testului de diagnostic . În plus, statistica Kappa a fost determinată pentru a estima acordul dintre cele trei teste utilizate și nPCR. Valoarea kappa a fost caracterizată în conformitate cu Kantere și colegii săi în 2015, unde valoarea Kappa 1 indică acordul absolut, în timp ce o valoare de 0 indică faptul că Acordul are loc din cauza întâmplării. În general,valorile Kappa mai mari de 0,6 indică un nivel bun de acord; analiza a fost efectuată folosind pachetul statistic SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, S. U. A.).

nouăzeci și unu punct unu (91,1) % dintre câinii pozitivi pentru CPV-2 de către nPCR au fost crescuți pur; 95.5% dintre pacienți aveau vârsta cuprinsă între două și opt luni, iar 4,5% aveau vârsta mai maredecât un an. În ceea ce privește starea lor de vaccinare, 40% au fost vaccinați cel puțin o dată pentru a preveni infecția cu CPV-2.

frecvența semnelor clinice manifestate de acești câini a fost următoarea: 44,4% au prezentat vărsături și diaree; 20% au prezentat febră, vărsături și diaree(catarală sau hemoragică); 17,7% au prezentat doar diaree; 8,8% au prezentat doar vărsături; iar 4,4% au prezentat diaree și febră, iar 4,4% au prezentat vărsături și febră.Leucopenia a fost observată la 48,8% dintre câini (Tabelul 1).

prin examinarea clinică, medicii veterinari au diagnosticat doar 57,8% dintre pacienți pozitivi la CPV-2 și 100% dintre câinii negativi; prin urmare, valoarea sensibilității pentru diagnosticul clinic a fost estimată la 57,7% (IÎ0.95 42,2–72), iar specificitatea observată a fost de 100% (IÎ0.95 46,2–98,8).

în ceea ce privește diagnosticul testelor de laborator, din 100% dintre câinii care au rezultat pozitiv prin nPCR, doar 30/45 dintre acești pacienți au fost CPV-2 pozitivi prin testul imunocromatografic, în timp ce cei cinci pacienți de control care au testat negativ pentru CPV-2 au fost diagnosticați corect. Prin urmare, această tehnică a arătat o sensibilitate de 66,6% (CI0.95 50,9–79,5), iar specificitatea observată a fost de 100% (CI0.95 46,2–98,8).

folosind tehnica PCR, 36/45 pacienți au fost pozitivi la CPV-2, iar cei cinci pacienți de control au fost confirmați negativi pe tot parcursul nPCR. Astfel, PCR a demonstrat o asensibilitate de 80% (CI0.95 63.1–87.7) și o specificitate de 100% (CI0.95 67.8–99.1) (Fig. 1).

Acordul dintre cele trei tehnici este demonstrat prin valoarea Kappa (Tabelul 2).

gastroenterita cauzată de CPV-2 este considerată una dintre principalele boli virale care afectează câinii. Deși semnele clinice ale infecției cu parvovirus canin pot varia, cele mai frecvente semne raportate au fost: anorexie, depresie, letargie ,febră, diaree mucoidă și hemoragică și leucopenie ; în cazurile subclinice, unele dintre aceste semne pot fi sau nu prezente .

în timpul examenului clinic, s-a observat variabilitatea manifestărilor clinice ale infecției. Doar 20% dintre câinii studiați au prezentat semne tipice ca de obiceidescrise în literatură. Variabilitatea clinică pentru această boală a fost raportată anterior , iar unii autori au discutat factori, cum ar fi vârsta, statusul imunitar, calea de expunere, doza virală, virulența tulpinilor și coinfecția cu alți agenți infecțioși ca posibile cauze . Acest lucru complică obținerea unui diagnostic precis al CPV-2 atunci când medicii veterinari se bazează exclusiv pe examenul clinic. Prin urmare, în ceea ce privește investigația noastră bazată exclusiv pe această procedură, 42,2% dintre câini vor avea un diagnostic CPV-2 fals negativ.Prin fișele medicale ale câinilor din acest studiu, am observat că veterinarii excludeau posibilitatea infecției în primul rând pentru că câinii nu prezentau semnele clinice clasice descrise în literatură, fuseseră vaccinați împotriva CPV-2 și/sau erau adulți. Cu toate acestea, majoritatea câinilor din studiul nostru au prezentat semne atipice. Prin urmare, considerăm că infecțiile subclinice ale CPV-2 sunt mai frecvente, iar medicii veterinari, care trebuie să decidă dacă să utilizeze sau nu teste diagnostice suplimentare cu sensibilitate și specificitate ridicate, ar trebui să ia în considerare cu seriozitate aceste constatări.

în acest studiu, 40% dintre pacienții pozitivi la CVP-2 au fost imunizați anterior. Este bine cunoscut faptul că tehnica PCR este foarte sensibilă și, prin urmare, detecteazăparticule virale vaccinate în fecale de la pacienții recent vaccinați; studiile indică faptul că este posibil să se obțină rezultate fals pozitive din zilele 3 până la 10post-vaccinare cu un vaccin CPV viu modificat . În consecință, pentru a efectuaacest studiu, pacienții cu antecedente de vaccinare în ultimele 15 zile au fost excluși. În plus,au fost secvențiate probe de la câini vaccinați pozitivi la CPV-2, iar în toate cazurile studiate a fost identificat CPV-2c genovariant (datele nu arată), ceea ce implică faptul că câinii au fost infectați cu CPV-2c de câmp, știind că nu este disponibil încă CPV-2cvaccin în Mexic. Mai mult, în Mexic, Pedroza și colegii au raportat că cea mai frecventă variantă antigenică la câinii infectați a fost CPV-2c .

pe de altă parte, mulți veterinari consideră prezența leucopeniei, un factor de susținere pentru diagnosticul CPV-2. Cu toate acestea, am observat că doar 48.8% (22/45) din câinii studiați au prezentat leucopenie în timpul evaluării, ceea ce este în concordanță cu alte rapoarte care au indicat că aproximativ 50% dintre câini nu prezintă modificări hematologice la momentul evaluării . Prin urmare, un CBC este un instrument valoros care poate oferi informații despregravitatea bolii, sugerând un prognostic și determinând răspunsul la tratament. Cu toate acestea,leucopenia nu trebuie considerată un instrument de diagnostic pentru CPV-2, deoarece nu oferă dovezi pentru prezența virusului.

diferite tehnici de identificare virală sunt utilizate pentru confirmarea definitivă a infecției cu CPV-2, de exemplu, teste rapide bazate pe imunocromatografiesunt utilizate pe scară largă de către medici, deoarece procedura este ușoară, rapidă și accesibilă. În plus, nu necesită pregătirea eșantionului sau trimiterea la un laborator specializat pentru analiză. Sensibilitatea variabilă a acestui test este dezavantajul său; mai multe studii au indicat că sensibilitatea sa variază de la 50 la 100% , iar în studiul nostru, sensibilitatea comparativă cu nPCR a fost de 66,6%. Unele studii au sugerat că sensibilitatea scăzută a tehnicii se datorează necesității unei cantități mari de particule virale care să fie vărsată în scaunul câinilor pentru a obține un diagnostic pozitiv . Utilizarea acestei tehnici trebuie reconsiderată, deoarece se așteaptă o probabilitate mai mare de rezultate fals negative. Pentru a preveni acest lucru,trebuie utilizate tehnici suplimentare, cu sensibilități mai mari .

mai multe studii au demonstrat sensibilitatea ridicată a testelor bazate pe PCR; în prezent, există mai multe variante ale aceleiași proceduri care oferă sensibilitățivariază de la 80 la 100% . În studiul de față, PCR a avut o sensibilitate de 80% și este demn de menționat faptul că pacienții au fost identificați doar cu infecție pozitivă prin nPCR, între timp nici testele PCR, nici imunocromatografia nu au reușit să o identifice.

în ceea ce privește valoarea kappa, am comparat rezultatele dintre cele trei metode analizate cu nPCR. Cu toate acestea, acordul slab dintre diagnosticul clinic și NPCR a fost demonstrat; a fost observat un acord moderat între PCR convențional și nPCR, care se poate datora asemănării dintre cele două teste.

în ceea ce privește semnele clinice, prezența vărsăturilor sau a diareei a fost observată la toți pacienții infectați viral, în timp ce alte semne clinice nu au fost considerate relevante pentru infecție; în concordanță cu semnele clinice și sensibilitatea tehnicilor utilizate, nu a fost observată nicio relație. 26 a prezentat doar vărsături ca semn clinic și a fost considerat negativ pentru CPV-2 prin diagnosticul clinic veterinar, cu toate acestea, testul de imunocromatografie, PCR și npcrtestele au fost pozitive pentru CPV-2. Mai mult, cazurile 41 și 42 în care principalul semn clinic a fost diareea, au putut fi diagnosticate doar pozitiv la CPV-2 folosind nPCR.

datele noastre indică faptul că cele mai frecvent utilizate teste de diagnostic în laboratoarele clinice și diagnostice veterinare pentru detectarea CPV-2 sunt foarte specifice, dar elesensibilitate redusă, care împiedică diagnosticul precis al CPV-2. În studiul nostru, testul PCR și imunocromatografia nu au fost la fel de sensibile ca nPCR, ceea ce a fost confirmatîn investigațiile anterioare , cu toate acestea, utilizarea nPCR ca test de diagnostic nu este încă larg răspândită în spitalele veterinare,în timp ce rămâne utilizată pe scară largă în scopuri de cercetare.

pe de altă parte, PCR în timp real, care este, de asemenea, extrem de sensibil, este rar utilizat, din cauza costurilor ridicate ale echipamentului și a cerinței unui personal foarte specializat pentru manipularea acestuia. Cu toate acestea, progresele tehnologice au permis acestor tehnici să devină mai ieftine și mai simple de utilizat, ceea ce ar putea duce la aplicarea lor directă în spitalele veterinare pentru a îmbunătăți precizia diagnosticului pentru CPV-2.