proteine purificationEdit
Polyhistidine-tag-uri sunt adesea folosite pentru purificarea afinitate de polyhistidine etichetate proteine recombinante exprimate în Escherichia coli și alte sisteme de Expresie procariote. Celulele bacteriene sunt recoltate prin centrifugare, iar peletele celulare rezultate sunt lizate fie prin mijloace fizice, fie prin detergenți și enzime, cum ar fi lizozimul sau orice combinație a acestora. În acest stadiu, lizatul brut conține proteina recombinantă printre multe alte proteine provenite de la gazda bacteriană. Acest amestec este incubat cu o rășină de afinitate care conține ioni legați de nichel bivalent sau cobalt, care sunt disponibili comercial în diferite soiuri. Nichelul și cobaltul au proprietăți similare și sunt metale de tranziție adiacente perioadei 4 (V. triada de fier). Aceste rășini sunt în general sepharose / agaroză funcționalizate cu un chelator, cum ar fi acidul iminodiacetic (Ni-IDA) și acidul nitrilotriacetic (Ni-NTA) pentru nichel și carboxil-metil aspartat (Co-CMA) pentru cobalt, pe care polihistidina-tag se leagă cu afinitate micromolară. Ernst Hochuli și colab. cuplat în 1987 ligandul NTA și ionii de nichel la margele de agaroză. Rășina este apoi spălată cu tampon fosfat pentru a îndepărta proteinele care nu interacționează în mod specific cu ionul de cobalt sau nichel. Cu metode bazate pe Ni, eficiența spălării poate fi îmbunătățită prin adăugarea de imidazol de 20 mM (proteinele sunt de obicei eluate cu imidazol de 150-300 mM). În general, rășinile pe bază de nichel au o capacitate de legare mai mare, în timp ce rășinile pe bază de cobalt oferă cea mai mare puritate. Puritatea și cantitatea de proteine pot fi evaluate prin SDS-PAGE și Western blotting.
purificarea prin afinitate folosind o etichetă de polihistidină are ca rezultat de obicei proteine relativ pure atunci când proteina recombinantă este exprimată în organisme procariote. În funcție de aplicațiile din aval, inclusiv purificarea complexelor proteice pentru a studia interacțiunile proteice, purificarea de la organisme superioare, cum ar fi drojdiile sau alte eucariote, poate necesita o purificare de afinitate tandem folosind două etichete pentru a obține o puritate mai mare. Alternativ, purificarea într-o singură etapă folosind ionii de cobalt imobilizați, mai degrabă decât ionii de nichel, produce, în general, o creștere substanțială a purității și necesită concentrații mai mici de imidazol pentru eluția proteinei his-tagged.
etichetarea Polihistidinei este opțiunea de alegere pentru purificarea proteinelor recombinante în condiții de denaturare, deoarece modul său de acțiune depinde numai de structura primară a proteinelor. De exemplu, chiar și atunci când o proteină recombinantă exprimată forțat în E. coli produce un corp de incluziune și nu poate fi obținut ca o proteină solubilă, poate fi purificată cu denaturare cu uree sau clorhidrat de guanidină. În general, pentru acest tip de tehnică, legarea histidinei este titrată folosind pH în loc de legarea imidazolului—la un pH ridicat, histidina se leagă de nichel sau cobalt, dar la pH scăzut (~6 pentru cobalt și ~4 pentru nichel), histidina devine protonată și este concurată în afara ionului metalic. Comparați acest lucru cu purificarea anticorpilor și purificarea GST, o condiție prealabilă pentru care este plierea adecvată (nativă) a proteinelor implicate. Pe de altă parte, se spune că eticheta lui tinde să se agregeze și să se insolubilizeze mai mult decât alte etichete de afinitate.
coloanele Polyhistidine-tag păstrează mai multe proteine bine cunoscute ca impurități. Una dintre ele este peptidil prolil izomeraza de tip FKBP, care apare în jurul valorii de 25kda (SlyD). Impuritățile sunt în general eliminate folosind o tehnică cromatografică secundară sau prin exprimarea proteinei recombinante într-o tulpină de E. coli cu deficit de SlyD. Alternativ, comparând cu rășinile pe bază de nichel, pe bază de cobalt au o afinitate mai mică cu SlyD de la E. coli, dar în mai multe cazuri, este moderat util.
proteine cu un număr diferit de etichete polihistidină elută diferit de rășina cu afinitate de nichel. Pentru proteinele cu o singură etichetă hexahistidină, imidazolul de 75 mM permite eluția din Ni-NTA, în timp ce pentru proteinele cu două etichete hexahistidină, imidazolul de 100 mM este necesar pentru eluție. Această eluție treptată poate fi utilizată pentru a izola ansambluri de proteine specifice dintr-un amestec, cum ar fi heteromultimerii definiți (de exemplu, un heterodimer AB dintr-un amestec care include HOMODIMERI AA și BB, dacă numai subunitatea B are o etichetă de polihistidină). O astfel de abordare a fost utilizată în izolarea streptavidinei monovalente.
teste de Legaredit
etichetarea Polihistidinei poate fi utilizată pentru a detecta interacțiunile proteină-proteină în același mod ca un test pull-down. Cu toate acestea, această tehnică este în general considerată a fi mai puțin sensibilă și, de asemenea, restricționată de unele dintre aspectele mai delicate ale acestei tehnici. De exemplu, condițiile de reducere nu pot fi utilizate, EDTA și multe tipuri de detergenți nu pot fi utilizate. Progresele recente în interferometria cu polarizare duală pot fi supuse EDTA și unei utilizări mai largi a reactivilor, iar utilizarea unor astfel de etichete specifice site-ului simplifică foarte mult măsurarea directă a modificărilor conformaționale asociate.
Hexahistadine cydye tag-uri au fost, de asemenea, dezvoltate. Acestea utilizează coordonarea covalentă a nichelului la grupurile EDTA atașate la fluorofori pentru a crea coloranți care se atașează la eticheta de polihistidină. Această tehnică s-a dovedit a fi eficientă pentru urmărirea migrației și traficului de proteine. Au existat, de asemenea, descoperiri recente care arată că această tehnică poate fi eficientă pentru a măsura distanța prin transferul de energie prin rezonanță fluorescentă.
a fost raportată o etichetă polifluorohistidină pentru utilizare în sistemele de traducere in vitro. În acest sistem, se utilizează un cod genetic extins în care histidina este înlocuită cu 4-fluorohistidină. Analogul fluorurat este încorporat în peptide prin specificitatea relaxată a substratului ligazei histidină-Arnt și scade pKa globală a tag. Acest lucru permite îmbogățirea selectivă a peptidelor etichetate cu polifluorohistidină în prezența amestecurilor complexe de etichete tradiționale de polihistidină prin modificarea pH-ului tampoanelor de spălare.
