rapoarte oncologice

Introducere

deși terapiile noi au fost recent introduse în practica clinică pentru tratamentul cancerului de prostată avansat, cancerul de prostată a rămas al doilea cel mai mort cancer la bărbații din Statele Unite în 2014 (1). Noi obiective terapeutice și strategii sunt urgent necesare pentru a îmbunătăți în continuare rezultatul clinic al pacienților cu cancer de prostată.

o țintă terapeutică potențială promițătoare estekinaza 5 dependentă de ciclină (CDK5). CDK5 este o serină / treonină kinazestructural similar cu alte CDK (2). CDK5 nu pare să aibă un rol major în reglarea ciclului celular (3,4). A fost bine caracterizat pentru rolul său dominant în dezvoltarea sistemului nervos central, incluzând rolurile în migrarea neuronală ,diferențierea și adeziunea (5,6). Weand alții au arătat ulterior că CDK5 joacă un rol important îndezvoltarea cancerului și metastazele (7-12). În celulele canceroase de prostată, am demonstrat că CDK5 a fost critic pentru integritatea scheletului, migrarea și invazia celulelor și invivo pentru metastaze (7). Inpancreatic cancer, CDK5 este intrinsecă semnalizării KRAS prin calea de transducție a semnalului ral de importanță centrală, oferind astfel o țintă potențială ‘drogabilă’ pentru tumorile KRAS mutante (8). Împreună, aceste studii indică faptul căinhibarea CDK5, singură sau în combinație cu alți agenți, poate oferi o strategie terapeutică eficientă pentru aceste și alte tipuri de cancer.

în studiul de față ne-am propus să identificăm agenți care ar fi deosebit de eficienți în combinație cu Cdk5inhibiția în celulele cancerului de prostată. Prin urmare, am efectuat caecran al Bibliotecii de droguri Johns Hopkins (JHDL). JHDL este o colecție de 3.360 de compuși farmaceutici care au finalizat cu succes testarea siguranței la om pentru o varietate de aplicații(13,14). Această bibliotecă a fost utilizată cu succes pentru reutilizarea compușilor pentru terapia cancerului,inclusiv identificarea digoxinei ca inhibitor al HIF1a (15) și a itraconazolului ca inhibitor al angiogenezei (16). Am folosit anterior JHDL pentru a identifica bromura de cetrimoniu și irinotecanul ca compuși cu activitate antitumorală crescută împotriva celulelor cancerului de prostată care exprimă niveluri scăzute ale genei supresoare a metastazelor n-mycdownregulated gene 1 (NDRG1) (17).Aici, am efectuat un screening JHDL similar cu celulele cancerului de prostată care diferă în activitatea CDK5. Tilorona a fost identificată ca fiind asociată cu letalitatea sintetică in vitro a celulelor canceroase de prostată cu deficit de ddk5.

materiale și metode

culturi celulare

PC3 linii celulare de cancer de prostată au fost obținute de laatcc. Aceste celule sunt derivate dintr-o metastază osoasă de la un pacient cu cancer de prostată de 62 de ani. Fibroblastele de prostată umane, de tipfurnizate de Dr.J. Isaacs, au fost obținute dintr-o biopsie de prostată pe un pacient cu cancer de prostată în vârstă de 62 de ani, cu un scor Gleason de 4. Ambele linii celulare au fost cultivate și menținute în medii RPMI-1640 (Invitrogen)suplimentate cu 10% ser fetal bovin. Celulele au fost cultivate într-un incubator umidificat la 37 de grade C într-o atmosferă de 5% CO2.

crearea liniei celulare PC3 CDK5dn

pierderea funcției CDK5 a fost realizată în celulele PC3 prin transfecția unui construct dominant-negativ care conține o D144nmutație, oferită cu amabilitate de Dr.L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Protocolul utilizat a fostdescris anterior (7). Pe scurt, construcția a fost subclonată într-un vector Tet bidirecțional, pBI-EGFP(bd Biosciences), care avea o genă de rezistență la zeocină adăugată pentru selecție (oferită cu amabilitate de Dr.K. Schuebel, școala de Medicină Universitară Johns Hopkins). vectorul gol PBI-EGFP sau vectorul PBI-EGFPCDK5dn a fost transfectat în celule PC3 care conțineau atet-off promotor construct, pTTa (bd Biosciences).

Western blotting

Western blotting a fost efectuat conform descrierii anterioare (19). Zece micrograme de proteine au fost încărcate pe gel. Anticorpii primari au fost dizolvați înblocare tampon . A fost utilizată o diluție de 1:1.000 pentru anti – CDK5 (Sigma-Aldrich); anti-vinculin (Millipore,Upstate) a fost diluat 1: 4.000. Anticorpii secundari au fost diluați cu diluție ata 1:4000. A fost efectuată normalizarea intensității benzii cu proteina menajeră vinculină. Au fost dezvoltate blot-uriconservate folosind un scaner Microtek.

testul de vindecare a rănilor

testele de vindecare a rănilor au fost efectuate cu controlul confluentPC3 (conținând vectorul PBI-EGFP gol) sau PC3 CDK5dncells. Un răzuitor cu vârf de cauciuc a fost folosit pentru a răzui o zonă decelule. Imagini microscopice ușoare au fost capturate imediat și 24 hafter răzuire.

screening-ul bibliotecii cu molecule mici

biblioteca JHDL a fost descrisă anterior(13,14,17).Depozitarea și screeningul compușilor JHDL au fost efectuate conform descrierii anterioare (17).Pe scurt, celulele de control PC3 și CDK5dn au fost însămânțate în plăci cu 96 de puțuri(1 103 celule/puț) și au fost lăsate să adere peste noapte. Apoi s-au adăugat 5 unqq de medicamente, depozitate ca soluții stoc de 200 oqqm inDMSO/H2O, pentru a completa mediile RPMI, astfel încâtcelulele au fost tratate la o concentrație finală de 10 oqqm. După 48 de ore de tratament, s-au adăugat la fiecare puț 20 de until de reactiv MTS din testul de proliferare celulară non-radioactivă AqueousNon 96 de until pentru o durată de 2-4 ore la 37 de until C. Plăcile au fost analizate folosind cititorul de plăci aSoftMax Pro (dispozitive moleculare). Proliferarea celulelor tratate a fost comparată cu proliferarea celulelor PC3control sau CDK5dn tratate cu DMSO (indice de proliferare). Indicatorii de proliferare ai celulelor PC3 CDK5dn au fost comparați cu indicatorii de proliferare ai celulelor de control PC3. Un studiu PubMed a fost efectuat pentru a evalua utilizarea clinică a potențialelor hit-uri.

testele MTS

testele MTS au fost efectuate pentru a măsura efectul antiproliferativ al tratamentului cu tiloronă. Tiloronedihidroclorura (Sigma-Aldrich) a fost depozitată sub formă de soluție de stoc de 10 mM în DMSO la -20 ct. O mie de celule PC3 au fost placate înplăci cu 96 de puțuri care conțin 100 de medii RPMI complete de unqql. La aproximativ 50% confluență, s-a administrat diclorhidrat de tiloronă. Pentruexperimente compusul a fost diluat în medii RPMI complete pentru a obține concentrația finală dorită. După tratamentul timp de 72 de ore(monoterapie cu tiloronă), s-a adăugat reactivul MTS, iar absorbția at490 nm a fost determinată folosind un cititor de plăci SoftMax Pro.S-au calculat indicii de proliferare; au fost utilizate ca acontrol celule de control PC3 netratate orCDK5dn (în medii RPMI complete de 103 unqql). Testele T ale studenților au fost efectuate pentru a evalua valorile P.

teste Clonogene

s-au efectuat teste Clonogene pentru a evalua supraviețuirea pe termen lung după tratamentul cu tiloronă. Celulele cancerului de prostată au fostplasat în vase de 60 mm și lăsat să adere. La confluența de 50-60%, celulele au fost tratate cu tiloronă timp de 72 h. ulterior, 1 103 celule din fiecare vas au fost placate în trei exemplare în vase de 60 mm și incubate în medii RPMI complete timp de 12 zile.Coloniile au fost fixate și colorate cu o soluție care conține 90% metanol și 10% soluție violet cristal (2,3% violet cristal, 0,1% oxalat de amoniu și 20% alcool etilic; Sigma). Coloniile au fostconservate cu un scaner de calculator (Microtek) și numărate manual.Testele T ale studenților au fost efectuate pentru a evalua dacă diferențele dintre liniile celulare au fost semnificative statistic.

test de creștere 3D

s-au efectuat teste de creștere 3D utilizând același protocol descris anterior (17). Pe scurt, sferoizii au fost generați deculturarea celulelor PC3 timp de 16 ore ca o picătură agățată peste o placă umidificată într-un incubator de CO2 în mediaconținând 0,5% metilceluloză. Sferoidele au fost încorporate în matricea colagenului( bd Biosciences), tratate cu tiloronă și imaginate cu ajutorul unui microscop Nikon Eclipse Ti (Nikon) în ziua tratamentuluiși la șase zile după începerea tratamentului. Zonele sferoide și totale (spheroidplus sprouts) au fost măsurate cu ImageJ. Creșterile de Fold au fost calculate prin împărțirea sferoidului/suprafeței totale în ziua 6 la sferoidul / suprafața totală în ziua 0 pentru fiecare sferoid individual. Pentru fiecare linie celulară și punct de timp, au fost înregistrate creșteri de patru sferoizi. Analizele statistice au fost efectuate cu ajutorul testelor studenților.

rezultate

suprimarea activității CDK5

celulele cancerului de prostată PC3 au fost alese pentru ecranul JHDLcompound datorită potențialului lor extrem de metastatic și independenței androgenice, asemănându-se astfel cu cancerul de prostată metastatic agresiv rezistent la gastrate. Activitatea CDK5 a fost inhibată detransfecția și selectarea unei mutații dominante-negative (CDK5144N). Aceste celule PC3 CDK5dn au avut un nivel proteic mai ridicat de totalCDK5 comparativ cu celulele de control PC3 (celule PC3 transfectate cu un vector gol) (Fig. 1A). Testul de vindecare (8) a confirmat că CDK5 a fost inactiv din punct de vedere funcțional în aceste celule; spre deosebire de celulele PC3control, celulele PC3 CDK5dn nu au avut capacitatea de a invada suprafața răzuită (Fig.1B).

ecran de bibliotecă pentru compuși care vizează celulele pcc3 pe baza activității CDK5

s-a efectuat un test de screening cu randament ridicat pentru selectarea compușilor care vizează celulele PC3 pe baza activității CDK5. Celulele PC3control și CDK5dn au fost tratate cu toți compușii de jhdl la 10 centimm timp de 48 de ore. Pentru a identifica accesările care vizează selectivc3 celule bazate pe expresia CDK5, am selectat toți compușii încare raportul indicelui de proliferare (CDK5dn/control) a fost sub 0,5 sau peste 1,5 (Fig. 2A).Mai mult, hit-urile au trebuit să inhibe proliferarea celulară a celulelor PC3 cu cel puțin 10%, deoarece am fost interesați în mod specific de compuși careinhibat creșterea celulelor (linie orizontală și verticală în grafic). De asemenea, am selectat toți compușii care au inhibat proliferarea celulelor în celulele PC3 cu 70% (colțul din stânga jos al graficului), deoarece am fost interesați de identificarea potențialilor agenți antitumorali foarte eficienți. În total, 41 de accesări au fost selectate pentru evaluare ulterioară.

s-a efectuat un ecran secundar în care s-au adăugat its-uri selectate din ecranul primar la 10 xqtm timp de 48 h la celulele PC3control și CDK5dn în trei exemplare, pentru a elimina rezultatele pozitive false (Fig. 2B). Valorile limită au fost puțin mai puțin stricte decât în ecranul primar; compușiau fost considerate un hit atunci când raportul dintre indicii de proliferare(CDK5dn/control) a fost sub 0,7 sau peste 1,4. Acest lucru a dus la identificarea a trei compuși care vizează selectiv celulele PC3 care exprimă cdk5: rutilantină, lactat de etacridină șiclorură de cetalconiu (Fig. 2C).Acești compuși nu au fost utilizați ca agenți antitumorali și utilizarea lor clinică potențială, deoarece agenții antitumorali intravenoși parlimitat (20-23). Un alt compus, tilorone analogR9536-DA, a fost extrem de eficient în inhibarea ambelor linii celulare PC3 izogene (>70% inhibare), dar a inhibat proliferarea celulelor PC3CDK5dn oarecum mai eficient (raport CDK5dn/control:0,687). Tilorona și analogii săi au activitate antivirală, acționând cel puțin parțial ca inductori de interferon (24-26)și s-a demonstrat preclinic și clinic că au și antitumorală (27,28).

tilorona țintește selectiv celulele PC3 cu activitate CDK5 scăzută

am continuat experimentele noastre cu diclorhidrat de tilor proaspăt dizolvat. După 72 de ore de tratament cu tiloronă la diferite concentrații, IC50–ul său a fost stabilit la 8-12 centimili în celulele PC3 CDK5dn și 15 centimili în celulele de control PC3 în testele MTS(Fig. 3A). La 8 MMCT, activitatea de proliferare a scăzut cu 24 și 47% în celulele martor PC3 și, respectiv, Cdk5dn (p=0,001). Pentru a evalua toxicitatea tiloronei încelulele normale de prostată, s-au efectuat teste MTS cu tiloronetratamentul fibroblastelor de prostată umane (Fig. 3B). Sensibilitatea acestor celule totilorona a fost similară cu cea a celulelor de control PC3.

efectul inhibitor al tiloronei în celulele PC3 a fost evaluat în continuare prin efectuarea de teste clonogene (Fig. 3C). Celulele PC3 CDK5dn au fost, de asemenea, semnificativ mai sensibile decât celulele de control PC3 la tiloronă în acest test. Tratamentul cu tiloronă de 10 centimetri a dus la o supraviețuire clonogenică de 40% în celulele PC3 CDK5dn și de 72% în celulele de control PC3(p=0,002).

a fost efectuat un test de creștere sferoidă pentru a evalua creșterea 3dtumorului și invazia celulelor PC3 la tratamentul cu tiloronă(Fig. 4). Atât celulele de control PC3, cât și celulele PC3CDK5dn au avut creșteri comparabile ale dimensiunii sferoidelor în șase zile. Cu toate acestea, dimensiunea totală (dimensiunea sferoidelor plus varza) a avut o creștere mai mare a celulelor de control PC3, confirmând că celulele CDK5DN PC3 netratate au avut un potențial invaziv scăzut comparativ cu celulele de control PC3. Când tilorona a fost administrată la 5 centimetri, sferoidele de control PC3 au avut o creștere similară și modele invazive ca celulele de control PC3 netratate (P=0,59) (Fig. 4B, graficul din stânga). Cu toate acestea, atunci când s-a administrat cloronă în aceeași concentrație la celulele PC3 Cdk5dn, s-a observat o scădere semnificativă atât a dimensiunii sferoidale, cât și a dimensiunii totale (p<0,01), sugerând că tilorona interzice cu succes creșterea sferoidală și invazia celulelor PC3 CDK5dn atunci când este administrată la 5 MMC (Fig. 4B, graficul din dreapta). La 10 MMC, ambele linii celulare izogene au avut un potențial invaziv redus.

discuție

JHDL, o bibliotecă de compuși farmaceutici bine caracterizați, a fost dezvoltată pentru a facilita studiile de eliminare a medicamentelor (29). Toxicitatea extensivă in vivo și profilurile farmacocinetice ale compușilor din bibliotecă permit dezvoltarea rapidă ulterioară a acestor compuși. Mai mulți compuși din JHDL au fost avansați în studiile clinice pentru cancer și alte aplicații terapeutice(13,14,16,17,30–32).

în studiul de față am analizat compușii JHDL care inhibă diferențiat creșterea celulelor canceroase în prezența inhibării CDK5; tilorona și un analog de tiloronă au fostidentificate ca agenți care vizează selectiv celulele canceroase PC3 cu deficit de CDK5. Tilorona (Amixin IC) este utilizată clinicîn unele țări ca agent antiviral activ pe cale orală (25). Tilorona a fost testată la ompentru tratamentul glioamelor cerebrale, papilomatozei laringiene și cancerului de sân (28,33,34).Deși a fost raportată eficacitatea antitumorală, interesul pentru tilorona pentruterapia cancerului a scăzut. Recent, Zhou și colab au raportatnoi analogi tilorone cu activitate anticanceroasă îmbunătățită (35). Acești analogi pot fi promițătoriexaminați, în special în combinație cu inhibarea CDK5.

în plus față de posibilitatea ca tilorona să fie promițătoare în combinație cu inhibarea CDK5, identificarea tiloronei ca agent care vizează selectiv celulele din cadrul cdk5 activ sugerează clase potențiale de medicamente pentru a potența eficiența inhibării CDK5. Tilorona a fost caracterizată ca inductor de aninterferon (24). Acest lucru sugerează că interferonul în sine sau un interferoninductor alternativ, cum ar fi un agonist TLR, poate fi util în combinație cu inhibitorul aCDK5. Cu toate acestea, pot fi implicate și alte mecanisme. De exemplu, tilorona este și un agent de intercalare a ADN-ului (24) și se poate imagina că poate modula structura cromatinei și expresia genelor. Pot fi implicate și alte funcții ale tiloronei, inclusiv căile de semnalizare și interacțiunile factorului de transcripție (36,37). Studii suplimentaresunt necesare pentru a descoperi mecanismul exact de acțiune prin caretilorona vizează selectiv cancerul de prostată CDK5-negativcelule.

mulțumiri

autorii doresc să mulțumească profesorilor P. J. Van Diestand E. Van der perete pentru sprijinul lor și discuții și ProfessorsM.A. Carducci și J. T. Isaacs pentru furnizarea de materiale de laborator. Acest studiu a fost susținut de către însoțitor de zbor MedicalResearch Institute, NCI R01 Ca085567, R01 ca134767, dod grantW81XWH-06-1-0139 și nci sport grant P50 ca58236. M. D. W. a fost susținut de Programul Dr. Saal van Zwanenbergstichting și HuygensScholarship.