secvențierea N-terminală, denumită adesea secvențierea Edman sau degradarea Edman este o tehnică importantă în studiul proteinelor și rămâne o abordare unică care poate produce noi date despre secvența proteinelor. Este, de asemenea, tehnica preferată pentru confirmarea rapidă a expresiei proteinelor.
chimia acestei abordări a fost introdusă pentru prima dată în 1950 de P. Edman de la Universitatea Lund din Suedia și dezvoltată în continuare în timpul activității sale din Melbourne, Australia, la ceea ce se crede a fi primul dispozitiv automat de secvențiere a peptidelor.
chimia lui Edman
Fig 1. Chimie de degradare Edman pentru secvențierea proteinelor n-terminale.
reacțiile chimice care produc aminoacidul marcat cu N-terminal hidrolizat sunt prezentate în fig 1. Fiecare ciclu include în esență 3 pași:
- cuplarea fenilizotiocianatului (PITC, reactivul Edman) la Alfa-Amina lanțului polipeptidic în condiții de bază pentru a forma o fracțiune de feniltiocarbamil (PTC).
- scindarea în condiții acide ușoare generează un amino terminal liber pe polipeptidă și un aminoacid adus de anilinotiazolinonă (ATZ).
- acesta din urmă este extras și transformat în continuare într-un derivat mai stabil de feniltiohidantoină (PTH).
reziduul PTH rezultat este analizat prin HPLC și timpii de retenție comparativ cu cel al standardelor aminoacizi PTH.
reacții adverse și subproduse
ciclul de secvențiere chimia și lucrul sunt bine controlate și produc specii perfect definite, există câteva subproduse care sunt detectate în timpul analizei.
după cum se arată în Figura 2, acestea provin în principal din hidroliza PITC și metanoliza în timpul ciclului și includ difeniltiouree (DPTU), n-fenil,O-metil-tiocarbonat (PMTC) și difeniluree (DPU), subproduse care coextrag și coelută cu PTH-aminoacizi.
