testul TUNEL este cel mai frecvent utilizat pentru a detecta celulele supuse apoptozei, care este o formă de moarte celulară programată. Apoptoza este un proces biologic important în timpul dezvoltării și pentru menținerea homeostaziei tisulare. Colorarea tunelului permite vizualizarea și cuantificarea celulelor apoptotice. Acest lucru îi ajută pe oamenii de știință să testeze eficacitatea noilor tratamente pentru tulburările în care apoptoza este fie inhibată, ca în cancer, fie îmbunătățită, ca în neurodegenerare.
acest videoclip va explica modul în care testul tunelului poate fi utilizat pentru a eticheta celulele supuse apoptozei, un protocol pas cu pas pentru efectuarea acestei metode în secțiuni de țesut și modul în care cercetătorii aplică această tehnică pentru a înțelege mecanismele morții celulare.
înainte de a intra în protocolul testului TUNEL, să discutăm principiile din spatele acestei tehnici.
una dintre numeroasele caracteristici distinctive ale apoptozei este fragmentarea ADN-ului. Cum se produce fragmentarea ADN-ului? Apoptoza este efectuată de enzime numite caspaze prezente în citosol. Rolul lor principal este de a scinda proteinele pentru a demonta celula. În plus, caspazele activează o enzimă numită dnază activată de caspază sau CAD, detașându-l de inhibitorul său—ICAD. Cad activat este o endonuclează care se deplasează către nucleu și scindează ADN-ul cromozomial.
scindarea ADN-ului determină în cele din urmă acumularea de fragmente de ADN cu capete crestate, iar testul tunelului etichetează fluorescent aceste capete crestate ale ADN-ului fragmentat, permițând oamenilor de știință să detecteze apoptoza. Dar cum se întâmplă asta? Pentru asta trebuie să înțelegeți reacția tunelului. TUNEL standuri pentru terminale deoxinucleotidil transferaza mediată dutp Nick-end etichetare. Cei doi reactivi principali ai tunelului sunt deoxinucleotidil transferaza terminală sau TdT și deoxiuridina trifosfat sau dUTP, care pot fi etichetate fluorescent pentru ușurința detectării.
pentru a înțelege reacția tunelului, să ne întoarcem la celulele apoptotice cu fragmente de ADN. Aceste fragmente crestate au grupări hidroxil 3′ libere. Odată ce adăugați reactivii tunelului la o probă care conține celule apoptotice, dutp-urile marcate fluorescent se atașează la aceste grupări hidroxil 3′ cu ajutorul enzimei catalizatoare TdT. Celulele colorate folosind această procedură se numesc celule pozitive TUNEL, care pot fi apoi vizualizate folosind microscopia fluorescentă.
acum că înțelegeți principiile și conceptele de bază din spatele testului TUNEL, să schițăm un protocol general pentru efectuarea acestei tehnici în secțiunile de țesut. Etapele majore ale testului tunelului includ fixarea țesutului de interes, permeabilizarea țesutului, adăugarea reactivilor tunelului, oprirea reacției tunelului și, în final, Analiza.
în primul rând, țesutul de interes trebuie fixat pentru a păstra structurile biologice. Fixarea funcționează prin reticularea proteinelor în celule. Pentru testul TUNEL, țesuturile pot fi fixate prin adăugarea lor într-o soluție care conține 4% paraformaldehidă timp de 4-24 ore la 4 centimetrii C. După fixare, criozecția țesutului în felii subțiri de 10 centimetrii sau mai puțin.
următorul pas este permeabilizarea, care permite reactivilor precum enzima TdT să pătrundă în nucleul celular. Permeabilizarea secțiunilor de țesut poate fi efectuată prin adăugarea țesutului la soluția de proteinază K timp de 5-15 minute la 37 centimetric C. clătiți secțiunile de țesut cu soluție salină tamponată cu fosfat pe un agitator orbital timp de 15-30 minute la temperatura camerei.
în urma permeabilizării, enzima TdT și dutp-urile marcate fluorescent sunt adăugate la secțiunile de țesut, împreună cu un tampon de etichetare care conține cobalt care acționează ca un cofactor pentru reacția tunelului. Împreună, amestecul de reacție a tunelului și secțiunea de țesut sunt incubate timp de 1-3 ore la 37 centimetric C și protejate de lumină pentru a preveni decolorarea fluorescenței.
după incubare, tamponul de oprire este adăugat la secțiunea de țesut pentru a opri reacția tunelului și, după o scurtă incubare, secțiunile sunt spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat. În cele din urmă, secțiunile de țesut colorate folosind dutp etichetat fluorescent sunt vizualizate folosind microscopie fluorescentă și evaluate pentru localizarea celulelor pozitive ale tunelului într-un țesut dat. Se poate cuantifica moartea celulelor pur și simplu prin numărarea procentului de celule pozitive TUNEL într-o anumită secțiune de țesut.
acum, că ați văzut cum să efectuați testul tunelului pentru a detecta celulele apoptotice, să discutăm despre modul în care acest test poate fi utilizat pentru a aborda întrebările adresate de biologii celulari.
moartea celulară apare ca o parte normală a dezvoltării pentru sculptarea țesuturilor și structurilor și pentru eliminarea celulelor inutile. Prin urmare, oamenii de știință interesați de acest fenomen studiază efectul expunerii prenatale la diferite substanțe asupra apoptozei în timpul dezvoltării. Aici, oamenii de știință au fost interesați să examineze efectul expunerii prenatale la alcool asupra dezvoltării creierului. Rezultatele colorării tunelului efectuate pe creierul fetal au evidențiat apoptoză crescută în țesuturile care au fost expuse prenatal la alcool, comparativ cu animalele de control.
oamenii de știință folosesc, de asemenea, testul TUNEL pentru a investiga apoptoza ca răspuns la infecția bacteriană. În acest experiment, oamenii de știință au dezvoltat un model de pneumonie prin injectarea șoarecilor cu Pseudomonas aeruginosa, care induce inflamația pulmonară. Apoi, țesutul pulmonar a fost îndepărtat și s-a efectuat colorarea tunelului pentru a examina apoptoza ca răspuns la infecția bacteriană. Rezultatele arată că moartea celulelor apoptotice a crescut la șoarecii expuși la bacterii, comparativ cu animalele de control.
în cele din urmă, colorarea tunelului poate fi utilizată pe probe de tumori umane, pentru a determina reacția tumorii la medicamente. În acest exemplu, probele tumorale au fost recoltate de la pacienți umani și cultivate ex vivo. Apoi, au fost tratați cu medicamente preclinice și evaluați pentru un răspuns folosind testul TUNEL. Datele obținute arată că tratamentul cu un medicament care inhibă proteina de șoc termic 90 crește semnificativ apoptoza în țesutul tumoral.
tocmai ați vizionat videoclipul lui JoVE despre utilizarea testului TUNEL pentru a detecta celulele supuse apoptozei. Acest videoclip a revizuit principiile din spatele colorării tunelului și un protocol pas cu pas pentru a efectua testul tunelului pe secțiuni de țesut. De asemenea, am analizat modul în care această metodă ar putea fi aplicată pentru a înțelege moartea celulară programată în timpul dezvoltării și bolii. Ca întotdeauna, mulțumesc pentru vizionare!
