sequenciação de N-terminal, muitas vezes referido como sequenciamento de Edman ou degradação de Edman é uma técnica importante no estudo de proteínas e continua a ser uma abordagem única que pode produzir novos dados de sequência de proteínas. É também a técnica preferida para a confirmação rápida da expressão proteica.
a química desta abordagem foi introduzida pela primeira vez em 1950 por P. Edman da Universidade de Lund na Suécia e desenvolvida durante seu trabalho em Melbourne, Austrália para o que acredita-se ser o primeiro dispositivo de sequenciamento de peptidos automatizado.
química de Edman
Fig 1. Química de degradação de Edman para sequenciamento de proteínas n-terminais.
as reacções químicas que produzem o aminoácido N-terminal hidrolizado são mostradas na Fig. 1. Cada ciclo inclui essencialmente 3 etapas:
- acoplamento do fenilisotiocianato (PITC, reagente de Edman) à Alfa-amina da cadeia polipeptídica em condições básicas para formar uma fracção de feniltiocarbamil (PTC).
- clivagem em condições ácidas ligeiras gera um amino terminal livre no polipéptido e um aminoácido adducido anilinotiazolinona (ATZ).
- este último é extraído e posteriormente convertido para um derivado mais estável da feniltiohidantoina (PTH).
o resíduo PTH resultante é analisado por HPLC e tempos de retenção em comparação com os padrões de aminoácidos PTH.
reacções laterais e subprodutos
a química do ciclo sequencial e o trabalho é bem controlado e produz espécies perfeitamente definidas, existem alguns subprodutos que são detectados durante a análise.
tal como demonstrado na Figura 2, provêm principalmente da hidrólise do PITC e da metanólise durante o ciclo e incluem difeniltioureia (DPTU), N-fenil,o-metil-tiocarbonato (PMTC) e difenilureia (DPU), subprodutos que co-extraem e co-eluem com aminoácidos PTH.
