Framsteg i genomisk testning-vad du behöver veta

framsteg i genomisk testning-vad du behöver veta

av Dr. Ch Weaver MD uppdaterad 9/1/2018

F: Vad är genomisk testning?

A: genomisk testning tittar på en grupp gener och deras varierande uttrycksnivåer. Detta genuttryck eller aktivitet kan karakterisera hur gener interagerar med varandra och förutsäga beteendet hos vissa vävnader i kroppen. Detta står i kontrast till genetisk testning, som tittar på en specifik förändring inom en enskild kromosom eller gen, ofta som en del av ett ärftligt drag.

F: Vilken roll spelar genomisk testning i en cancerdiagnos?
A: genomisk testning kan ge information om en patients prognos baserat på genuttrycket i en individs cancervävnad och kan ofta förutsäga om viss terapi (såsom kemoterapi) kommer att vara till nytta.

F: vid vilken tidpunkt i diagnosprocessen sker genomisk testning?
A: Genomisk testning kan inträffa när som helst efter att ett vävnadsprov (biopsi eller resektion) av cancer har förvärvats.

F. vilka frågor ska jag ställa mitt vårdteam om genomisk testning?
A: följande är de primära frågorna att ställa din vårdgivare.

• är genomisk testning tillgänglig för den typ av cancer jag har, för att hjälpa till att bestämma min övergripande prognos?
• kommer resultaten av denna testning att kunna ändra din hantering av cancer? Särskilt:
  • kommer testet att kunna berätta om vissa terapier kommer att vara till nytta i min behandling?
• har du haft positiva resultat med att använda denna testning med andra patienter?
• omfattas denna testning av min försäkringsplan? (Denna typ av testning kan köras i tusentals dollar, även om många planer täcker testerna utan en out-of-pocket-kostnad.)

f: finns det specifika cancertyper för vilka rollen av genomisk testning är särskilt betydelsefull?

A: Det finns tre typer av cancerpatienter för vilka genomisk testning kan vara särskilt fördelaktig:

• patienter med östrogenreceptorpositiv bröstcancer som ännu inte har spridit sig till lymfkörtlarna (bröstcancer i tidigt stadium) kan ha en prognos som är svår att förutsäga genom vävnadsbiopsi ensam. Genomisk testning kan inte bara hjälpa till att tillhandahålla prognostisk information (dvs. förutsagd 10-årig överlevnad) men kan också förutsäga om kemoterapi kommer att vara av någon signifikant fördel, vilket gör det möjligt för en patient att undvika toxiciteten hos kemoterapi när det är möjligt.
• patienter med vissa typer av tjocktarmscancer kan också dra nytta av genomisk testning när det gäller att bestämma prognos, förutsäga kemoterapifördelar och välja kemoterapi (bestämma vilka kemiska medel som kommer att vara mest fördelaktiga).
• patienter med en cancer som har spridit sig till andra ställen i kroppen (metastatisk sjukdom) eller som har återkommit lokalt (trots kirurgi och/eller kemoterapi) kan genomgå genomisk testning som tittar på uttryck över en mängd olika gener, inklusive de som inte vanligtvis är associerade med den ursprungliga platsen för cancer. Denna typ av genomisk testning kan identifiera vissa gener som potentiellt kan vara ett mål för terapi som ursprungligen inte beaktades. En förändring till en riktad terapi skulle ha potential att markant förbättra överlevnaden.

Genomikens framväxande roll vid diagnos och övervakning av Cancer

översikt

Cancer är resultatet av genetiska avvikelser som påverkar funktionen hos vissa gener. Gener bestämmer cellens form, funktion och tillväxtmönster. De som accelererar eller undertrycker tillväxt är ofta involverade i cancer. Till exempel har många cancerformer en abnormitet i en gen som är ansvarig för att stimulera cellulär tillväxt och/eller genen som normalt förhindrar cancer fungerar inte korrekt. Båda dessa genetiska avvikelser kan resultera i okontrollerad och överdriven cellulär tillväxt, kännetecknet för cancer. Genomiska tester, eller analyser som de kallas av forskare, är ett verktyg för att identifiera de specifika generna i en cancer som är onormal eller inte fungerar korrekt. I huvudsak är detta som att identifiera den genetiska signaturen eller fingeravtrycket för en viss cancer.

genomisk testning skiljer sig från genetisk testning. Genetiska tester används vanligtvis för att avgöra om en frisk individ har en ärftlig egenskap (gen) som predisponerar dem för att utveckla cancer. Genomiska tester utvärderar generna i ett prov av sjuk vävnad från en patient som redan har diagnostiserats med cancer. På detta sätt identifieras gener som har muterat eller har utvecklat onormala funktioner utöver de som kan ha ärvts.

genomisk testning kan hjälpa läkare att:

• Bestäm en patients prognos (potentiellt resultat)
• Bestäm om en cancer är aggressiv/snabbväxande eller långsamt växande
• välj den mest effektiva behandlingen för varje enskild cancer
• övervaka patienter som genomgår behandling för att avgöra om behandlingen fungerar
• övervaka patienter som är i remission för att fånga en potentiell sjukdomsprogression tidigt när det är mer behandlingsbar

kanske det största löftet om genomisk testning är dess potential för individualisering av behandlingen. Detta innebär att patienter med allvarligare tillstånd kan identifieras och erbjudas aggressiva och innovativa terapier som kan förlänga deras liv, medan patienter som diagnostiseras med ett mindre allvarligt tillstånd kan skonas onödiga behandlingar. Till exempel kommer vissa kvinnor med nodnegativ bröstcancer att återfalla efter att ha behandlats med kirurgi ensam. Genomisk testning har visat sig skilja mellan vilka nodnegativa bröstcancerpatienter som är mer benägna att återfalla och därför dra nytta av ytterligare kemoterapi och vilka patienter kanske inte behöver kemoterapi.

för att uppskatta hur vetenskapen om genetik tillämpas på diagnos och övervakning av cancer, är det bra att ha en förståelse för de grundläggande principerna för genetik. Detta inkluderar att veta vad DNA, kromosomer och gener är, hur de fungerar och hur informationen i DNA omvandlas, genom genuttryck, till specifika strukturer som dikterar en Cells funktioner.

med denna bakgrundskunskap är det möjligt att förstå löftet om tester för att upptäcka genetiska avvikelser, såsom:

• fluorescens in situ hybridisering (FISH)
• polymeraskedjereaktion (PCR)
• omvänd transkription PCR
• Microarray technology
• Serumproteomics

Bakgrund—grundläggande principer för genetik

betydelsen av genetik i ärftlighet är välkänd; den roll som genetiken spelar för att kontrollera cellernas struktur och funktion kan dock vara ännu mer kritisk för en enskild organism. Ärftlighet försäkrar att människor och alla arter kan reproducera och fortsätta sina unika egenskaper och styra hur celler byggs, vilket arbete de gör och hur de växer är nödvändigt för att säkerställa att en organism kommer att överleva för att reproducera. En förståelse för denna kritiska roll som DNA och gener har för att bestämma cellens minut-för-minut-liv är också viktigt för att förstå hur genetik är involverad i cancer.

DNA: den genetiska informationen för en hel organism finns i kärnan i varje cell i form av deoxiribonukleinsyra, allmänt känd som DNA. DNA är en dubbelsträngad spiralformad (spiralformad) molekyl. Varje sträng består av en strukturell ryggrad plus en sekvens av kväveinnehållande föreningar som kallas kvävebaser, som kan betraktas som genetikens alfabet. Det finns fyra baser: adenin, guanin, tymin och cytosin. De två strängarna är anslutna vid baserna.

den genetiska koden, eller den genetiska informationen som styr cellens struktur och funktion, Finns i basföljden. Bassekvensen styr så småningom sekvensen av aminosyror som är kopplade ihop för att göra en proteinmolekyl. Olika sekvenser gör olika proteiner. Proteinerna som syntetiseras i en cell bestämmer strukturen och funktionen hos den cellen.

kromosomer: DNA är förpackat i ett specifikt antal enheter som kallas kromosomer. Människor har 46 kromosomer i varje cell. För det mesta packas kromosomerna tätt runt proteiner i cellens kärna så att de inte kan ses. Men i stadierna av cellens liv strax före celldelning blir kromosomerna synliga med ett ljusmikroskop. De verkar som ett kapital ” H ”med fyra längder av lindat DNA förenat med ett protein som” korset ”av”H”.

gener: DNA är organiserat i gener, som är långa segment av DNA som inkluderar regioner som innehåller koder för proteiner som kallas exoner, såväl som icke-kodande regioner som kallas introner. Gener definieras som den grundläggande enheten för ärftlighet eftersom de överförs till avkommor och sedan replikeras och vidarebefordras till enskilda celler under celldelning. Replikering innebär att man använder båda DNA-strängarna som mallar för att syntetisera gratis DNA (cDNA), vilket är en matchande sträng. Resultatet är två identiska kopior av DNA för varje cell efter att celldelningen är klar. Under normala förhållanden förblir DNA-strukturen och därmed gener relativt konstant genom replikering och celldelning.

genuttryck: den genetiska informationen i gener översätts till cellulär struktur och funktion genom en process som kallas genuttryck. Gener kan ses som koder eller recept för att göra proteiner. Proteiner är den grundläggande komponenten i cellstruktur och funktion. När en gen ”uttrycks” byggs proteinet eller proteinerna som det kodar för aktivt i cellen och funktionen som dessa proteiner tjänar utförs. Till exempel, när HER-2/neu-genen uttrycks i bröstcancer, finns det fler epidermala tillväxtfaktorreceptorer (EGFR) närvarande, vilka är proteiner på cellytan som HER-2 / neu kodar för. Dessutom är funktionen av EGFR att stimulera celltillväxt; så en cell som uttrycker HER-2 / neu har många EGFR och växer aktivt.

genuttryck sker genom ett komplext system som innefattar följande steg:

• tillfällig separation av de två strängarna i DNA-molekylen vid en viss gen.
• transkription av DNA-segmentet, vilket är syntesen av en enkelsträngad kopia av DNA-sekvensen som exponeras; denna kopia kallas messenger RNA (mRNA).
• proteinsyntes, eller bygga nya proteiner i cellen, baserat på informationen i mRNA.

genetiska avvikelser: Genetiska avvikelser är förändringar i DNA i en cell som kan uppstå av en slump eller på grund av miljöpåverkan. Dessa förändringar ger den drabbade cellen någon fördel jämfört med normala celler som hjälper dem att växa. Som ett resultat kan cellen dela sig snabbt och bli en cancertillväxt. Denna tillväxtfördel gynnar emellertid bara den enskilda cellen, och inte nödvändigtvis hela organismen (människan).

typer av genetiska avvikelser inkluderar:

translokationer-de förändrade platserna för en gen från en kromosom med en gen på en annan kromosom; denna typ av abnormitet definierar de många olika leukemierna

deletioner—en gen eller sekvens av nukleotider saknas i DNA

polymorfismer—variationer i nukleotidsekvens

tester för att upptäcka genetiska avvikelser

en mängd nya laboratorietester kan upptäcka genetiska avvikelser. Att hitta en sjukdomsframkallande mutation i en gen kan bekräfta en misstänkt diagnos av cancer eller identifiera de som är predisponerade för vissa cancerformer. Några av dessa tekniker som för närvarande används i klinisk miljö inkluderar:

• fluorescens in situ hybridisering (FISH)
• polymeraskedjereaktion (PCR)
• omvänd transkription PCR

vidare används följande laboratorietekniker i cancerforskning och kan vara tillgängliga för klinisk användning i framtiden:

• mikroarray

fluorescens in situ hybridisering (FISH)

fisk är en laboratorieteknik som används för att upptäcka genetiska avvikelser på encellig och enkelgennivå, såsom numeriska avvikelser (vinster och förluster av nukleotider) och translokationer (de förändrade platserna för en gen eller ett segment av gener på en kromosom med Gen eller ett segment på en annan kromosom). Dessa avvikelser spelar en roll i utvecklingen och utvecklingen av vissa cancerformer, såsom leukemier och lymfom1.

hur fungerar fisk? Fisk utförs på provceller vars DNA har unraveled så att de enskilda kromosomerna är synliga. Detta händer under cellfaser strax före celldelning, kallad metafas eller interfas. Prov-DNA denatureras först med hjälp av värme och den kemiska formamiden så att de enskilda strängarna separeras och exponerar bassekvensen. Därefter inkuberas eller kombineras specifika DNA-sekvenser, kallade prober, som är fästa vid färgade fluoros med prov-DNA. Sonderna hybridiserar (ansluter) med DNA i kromosomerna som är komplimangen till bassekvensen i sonden. Närvaron eller frånvaron av fluorescens från det hybridiserade DNA och sonden är synliga med ett specialiserat mikroskop och indikerar om DNA-sekvensen av intresse är närvarande i provet. Dessutom kan specialiserade FISKTEKNIKER användas för att upptäcka translokationer, inversioner och förstärkningar som är involverade i cancer.2

fisk i bröst-och äggstockscancer: en vanlig användning om fisk är att avgöra om patienter med bröst-och äggstockscancer överuttrycker HER2/neu-onkogen, en gen som vanligtvis är involverad i cancer. HER2 / neu bär den genetiska koden för HER2-receptorn, ett protein på ytan av vissa cancerceller. HER2 binder med tillväxtfaktorer i blodet, vilket stimulerar cancerceller att växa.

HER2/neu förstärks i cirka 20% till 30% av bröst-och äggstockscancer och denna förstärkning och/eller överuttryck indikerar en dålig prognos.3 fisk kan användas för att observera om HER2/neu-onkogenen skickar flera signaler på nivån för de enskilda cellerna, vilket indikerar genförstärkning.

fisk i hematologiska (blod) cancer: Fisk kan också användas för att diagnostisera och hantera olika hematologiska maligniteter. Den genetiska abnormiteten som ligger till grund för många hematologiska maligniteter är kromosomal translokation, eller de förändrade platserna för gen från en kromosom med en gen på en annan kromosom.

polymeraskedjereaktion (PCR)

PCR är en laboratoriemetod in vitro som är användbar för genetisk testning för sjukdom och detektering av minimal kvarvarande sjukdom, vilket är en liten mängd sjukdom kvar efter behandling som kan leda till återfall och är vanligtvis inte detekterbar med andra tekniker. Denna procedur förstärker ett segment av DNA från ett litet prov, vilket gör det detekterbart. Med PCR kan relativt små sekvenser av känt DNA replikeras i miljoner kopior under en kort tidsperiod.

hur fungerar PCR? Denna metod kräver fyra principkomponenter: 1) provet DNA, 2) en riklig tillförsel av nukleotider, 3) ett värmestabilt polymerasenzym som är ansvarigt för kopiering av DNA, och 4) primers, kort sekvens av nukleotider som ligger på vardera sidan av DNA-fragmentet av intresse och signalerar polymeraset för att börja replikera det specifika DNA-segmentet.

PCR är en trestegsprocess, var och en sker vid en annan temperatur. Provet DNA upphettas först till ungefär 90 OCCCC för att separera de 2 Parade DNA-strängarna. När den väl är separerad kyls den till en temperatur som gör det möjligt för primrarna att hybridisera till deras komplementära sekvens på mål-DNA, ungefär 40 ACC. Slutligen sker DNA-replikation vid ungefär 70 OCCC, den temperatur vid vilken DNA-polymeras är mest aktiv. Denna process upprepas 20 till 30 gånger, vilket resulterar i ungefär 1 miljon gånger amplifiering av DNA-fragmentet av intresse.4

omvänd transkription PCR

omvänd transkription (RT)-PCR är en teknik som detekterar graden till vilken gener uttrycks. Komplicerade processer styr vilket segment av DNA separerar, transkriberas (kopieras) till mRNA och uttrycks sedan som proteiner i cellen. Inte alla gener transkriberas och uttrycks sedan lika. På grund av många kontroller i cellen är vissa gener överuttryckta, vilket innebär att de transkriberas och uttrycks i högre takt än normalt, medan andra gener nu uttrycks eller ”stängs av” så att vissa funktioner inte manifesteras i cellen.

hur fungerar RT-PCR? RT-PCR använder samma steg som PCR för att förstärka ett segment av DNA, men provet är en gratis kopia av mRNA. Genom att börja med mRNA mäter detta test endast det DNA som uttrycks, vilket gör det möjligt att bestämma i vilken grad vissa gener uttrycks. Nya användningar av RT-PCR i klinisk onkologi inkluderar detektion av lymfkörtelmikrometastaser i prostatacancer och benmetastaser i bröstcancer.5

RT-PCR i bröstcancer: bröstcancertestet Oncotype DX Macau använder RT-PCR för att bestämma den individuella risken för återfall hos kvinnor med nodnegativ östrogenreceptor (ER)-positiv bröstcancer. Detta test utvärderar uttryck av 21 gener i bröstcancer. Överuttryck av några av dessa gener indikerar en sämre prognos, medan uttryck av andra kan indikera en bättre prognos. Uttrycket av alla 21 gener används för att beräkna en ”recidiverande poäng”, eller sannolikheten för att cancer kommer att återkomma. En stor klinisk studie visade att recidiverande poäng var mer effektivt för att förutsäga prognosen för kvinnor med nodnegativ, ER-positiv bröstcancer än standardåtgärder som patientens ålder, cancerstorlek och cancerstadium.6

strategier för att förbättra upptäckten av genetiska avvikelser

flera metoder för att upptäcka genetiska avvikelser används för cancerforskning. Medan de ännu inte rutinmässigt används i klinisk miljö, verkar följande vara lovande och kan användas i framtiden för att diagnostisera, testa och övervaka cancer.

mikroarrayer: mikroarrayanalys är en teknik som kombinerar biologi med datavetenskap för att generera en genetisk profil för ett givet vävnadsprov som återspeglar aktiviteten hos tusentals gener. Denna teknik har fördelar jämfört med fisk eller PCR eftersom den i en enda analys kan utvärdera uttrycket av alla gener som kan vara involverade i en cancer, snarare än bara några. Genom att grafiskt visa hur alla gener är involverade i en cancer kan mikroarrays generera en ”genetisk signatur” för en viss cancer. Detta gör identifieringen av cancersubtyp mer exakt. Förmågan att ta en ögonblicksbild av cancerens genetiska signatur kan leda till en bättre förståelse för hur den cancern utvecklas och hur man utformar individualiserad behandling.

hur fungerar mikroarrayer? Medan olika mikroarraymetoder används, består var och en av fem grundläggande steg:

• beredning av provet
• kombinera provet med datorchipet
• skanna datorchipet
• normalisering
• datoranalys av resultaten.

beredning av provet: i det inledande steget syntetiseras cDNA från RNA genom omvänd transkription (kom ihåg transkription innebär kopiering av DNA för att göra RNA, så omvänd transkription genererar DNA från RNA) från RNA som har extraherats från både ett test och ett referensprov. Prov – DNA-segmenten är märkta med fluorokromer eller radioaktiva kemikalier, så att de kan detekteras efter att de har kombinerats med datorchipet.

kombinera provet med datorchipet: därefter kombineras provet med datorchipet, vilket är ett rektangulärt rutnät av fläckar. Varje plats har många kopior av en viss DNA-sekvens. Dessa sekvenser härrör från offentliga databaser av DNA-sekvenser som genererades genom Human Genome Project, den vetenskapliga strävan som identifierade praktiskt taget alla DNA-sekvenser i den mänskliga arten.

när provet läggs till i datorchipet inträffar en process som kallas hybridisering. Detta innebär att provet DNA-segmentet binder (hybridiserar) till segmentet på datorchipet som har den exakta komplementära sekvensen av nukleotider (de fyra föreningarna som är genetikens alfabet).

skanna datorchipet: när hybridiseringen är klar används skannrar för att detektera fluorescensen och skapa en digital bild som återspeglar var prov-DNA kombineras med fläckar på mikroarraychipet.

normalisering: Eftersom raw-signalintensiteter kan variera mellan enskilda chips från många patienter eller experiment måste individuell chipintensitet anpassas till en gemensam standard eller normaliseras. Till exempel är subtraktion av bakgrundsbrus en vanlig normaliseringsmetod som tillämpas på alla prover. Normalisering gör det möjligt att jämföra genuttrycksprofiler från många patienter eller experiment.

datoranalys: det sista steget i ett mikroarrayexperiment är datoranalys. De tusentals rådata som är resultatet av mikroarrayanalyser är i huvudsak obegripliga om de inte utvärderas i samband med andra resultat. Till exempel kan genuttrycksprofilen (mikroarrayresultat) av normal och sjuk vävnad jämföras för att identifiera gener som varierar i deras uttryck och också identifiera ett mönster (profil) som kan indikera en distinkt klass eller sjukdomsstadium.7

mikroarrayer inom onkologi: Mikroarrayanalys har bidragit till onkologi genom att öka förståelsen för den genetiska grunden för flera typer av cancer, inklusive B-cell non-Hodgkins lymfom (BCNHL), akut leukemi och bröstcancer.

• betydande kunskaper om bcnhls patologi har vunnits genom att jämföra genuttrycksmönster av sjuk och normal vävnad. Två olika sjukdomskategorier visar distinkta genuttrycksprofiler. Mikroarrayer har hjälpt till att etablera dessa uttrycksprofiler och i framtiden kan de hjälpa till att exakt klassificera nya fall av BCNHL.
• vid akut leukemi har mikroarrayer hjälpt till att skapa distinkta genuttrycksmönster som har hjälpt till att skilja akut lymfocytisk leukemi (ALL) och akut myeloid leukemi (AML). Med hjälp av dessa profiler förutspåddes 29 av 34 nya fall av leukemi korrekt.
• dessutom har mikroarrayer hjälpt till att identifiera två distinkta genuttrycksprofiler i bröstcancer, BCRA1 och BCRA2. Detta resultat föreslår olika sätt att bröstcancer utvecklas och ger ledtrådar som främjar ytterligare förståelse för orsaken till bröstcancer.7

1 spagnolo SD, Ellis DW, Juneja S, Leong AS, et al. Rollen av molekylära studier i lymfomdiagnos: en översyn. Patologi 2004; 36 (1) 19-44.

2 Spurbeck JL, Adams SA, Stupca PJ, Dewald GW. Primer på medicinsk genomik del XI: visualisera mänskliga kromosomer. Mayo Clinic Förfaranden 2004: 79: 58-75.

3 Paik S, Hazan R, Fisher ER, et al. Patologiska fynd från national surgical adjuvant bröst-och tarmprojekt: prognostisk betydelse av ERB B-2-proteinöveruttryck i primär bröstcancer. J Clin Oncol 1990; 8: 103-112.

4 Tefferi A, Wieben ED, Dewald GW, et al. Primer på medicinsk genomik del II: Bakgrundsprinciper och metoder inom Molekylär Genetik. Mayo Clinic Förfaranden 2002; 77: 785-808.

5 Tefferi A, Wieben ED, Dewald GW, et al. Primer på medicinsk genomik del II: Bakgrundsprinciper och metoder inom Molekylär Genetik. Mayo Clinic Förfaranden 2002; 77: 785-808.

6 Paik S, Shak S, Tang G, et al. Multi-gen PT-PCR-analys för att förutsäga återfall i nodnegativa bröstcancerpatienter-NSABP-studier B-20 och B-14. Proc av den 26: e årliga San Antonio Breast Cancer Symposium. December 3-8k, 2003; San Antonio, TX, Abstrakt #16.

7 Tefferi A, Bolander ME, Ansell SM, et al. Primer på medicinsk genomik del III: Mikroarrayexperiment och dataanalys. Mayo Clinic Proceedings2002; 77: 927-940.