Die genetischen Grundlagen des adaptiven Melanismus in Taschenmäusen

Ergebnisse und Diskussion

Mäuse wurden an sechs Standorten in vier geografischen Regionen gesammelt, einschließlich heller und dunkler Substrate (Abb. 1A). In allen Fällen beobachteten wir eine enge Übereinstimmung zwischen der Substratfarbe und der Farbe der dorsalen Pelage (Abb. 1B). Mäuse aus Portal und Avra Valley waren gleichmäßig hell. Von den 29 Mäusen von der Pinacate-Stelle waren 16 von 18 Mäusen (89%), die auf der dunklen Lava gefangen wurden, dunkel, während 10 von 11 Mäusen (91%), die auf den hellen Felsen gefangen wurden, hell waren (Abb. 1B). In ähnlicher Weise waren von den 20 Mäusen aus Armendaris 7 von 8 Mäusen (88%), die auf der dunklen Lava gefangen wurden, dunkel, während alle 12 Mäuse (100%), die auf den hellen Felsen gefangen wurden, hell waren. In diesen Populationen war die phänotypische Variation der Farbe eher diskret als quantitativ; Alle Mäuse wurden leicht als hell oder melanisch klassifiziert, basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen einer subterminalen Bande von Phäomelanin auf einzelnen Haaren auf dem Rücken.

Prinzipiell sind mehrere Ansätze möglich, die einem interessierenden Phänotyp zugrunde liegenden Gene zu identifizieren. Jedoch, C. intermedius sind in Gefangenschaft schwer zu züchten, und daher ist jeder Ansatz, der auf Kreuzen beruht, nicht praktikabel. Stattdessen verwendeten wir Assoziationsstudien mit Kandidatengenen, um Mutationen zu identifizieren, die für die beobachteten phänotypischen Unterschiede verantwortlich sind. Ungefähr 1,5 kb intronische DNA aus dem Agouti-Locus wurden in 36 Mäusen sequenziert, darunter Vertreter aller Standorte. Die schwarz-bräunliche Mutation in der Labormaus erzeugt ein dunkles Dorsum mit ungebundenen Haaren und wird durch eine Insertion verursacht, die den dorsalen Promotor ≈15 kb 5’des Startcodons stört (15). Wir folgerten, dass eine ähnliche Mutation in C. intermedius durch Verknüpfung mit Polymorphismen an neutralen Stellen über moderate genomische Entfernungen (0-50 kb, abhängig vom Alter der Mutation) nachgewiesen werden könnte. Wir beobachteten 16 Einzelnukleotidpolymorphismen und 5 Insertions- / Deletionspolymorphismen, darunter mehrere bei Zwischenfrequenzen; Keiner zeigte eine Assoziation mit der Fellfarbe. Es gibt zwei mögliche Erklärungen für diesen Mangel an Assoziation: Entweder ist Agouti keine Hauptdeterminante der beobachteten phänotypischen Unterschiede, oder Agouti ist beteiligt, aber es gibt wenig oder kein Verknüpfungsungleichgewicht zwischen den von uns untersuchten Stellen und den funktionellen Stellen.

Beide Allele des gesamten Mc1r-Gens (954 bp) wurden in den 69 Mäusen in Fig. 1. Vierundzwanzig Einzelnukleotid-Polymorphismen wurden beobachtet: 15 waren synonym und 9 waren nicht-synonym. Vier der neun Aminosäurepolymorphismen wurden nur in den dunklen Mäusen aus der Pinacate-Lokalität beobachtet (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp und Gln-233 → His). Diese vier Aminosäurenvarianten waren bei den Pinacate Dark-Mäusen mit hoher Häufigkeit (82%) vorhanden und befanden sich in einem vollständigen Verknüpfungsungleichgewicht miteinander. Alle anderen Mc1r-Aminosäurepolymorphismen waren bei niedrigen Frequenzen vorhanden und zeigten keine Assoziation mit der Mausfarbe. Die Verteilung der Mc1r-Nukleotidvariation zwischen hellen und melanischen Mäusen von der Pinacat-Stelle ist in Tabelle 1 gezeigt.

Mehrere Beobachtungen legen nahe, dass eine oder mehrere dieser vier Aminosäurenmutationen (Stellen 18, 109, 160 und 233) für die hell / Dunkel-phänotypischen Unterschiede in der Pinakatenpopulation verantwortlich sind. Erstens gibt es eine perfekte Assoziation zwischen Genotyp und Phänotyp (Tabelle 2). In einer einzigen panmiktischen Population ohne assortative Paarung ist eine Assoziation zwischen genotypischer und phänotypischer Variation unerwartet, es sei denn, das Gen oder ein eng verknüpftes Gen ist für den Phänotyp verantwortlich. Die Populationsstruktur kann jedoch auch dann eine falsche Assoziation hervorrufen, wenn ein Gen nicht an den phänotypischen Unterschieden beteiligt ist (19). Wir testeten diese Hypothese durch Sequenzierung der mitochondrialen COIII- und ND3-Gene in allen Mäusen aus der Pinacate-Lokalität (n = 29). Eine Phylogenie dieser mitochondrialen Gene zeigt, dass Haplotypen von hellen und dunklen Mäusen vermischt sind, was keinen Hinweis auf eine versteckte Populationsstruktur liefert (Abb. 2). Da der größte Teil des Genflusses in Chaetodipus wahrscheinlich von Männern vermittelt wird (20) und weil das mitochondriale Genom eine effektive Populationsgröße von einem Viertel der effektiven Größe von Autosomen aufweist, bietet mitochondriale DNA einen empfindlichen Marker zum Nachweis der Populationsstruktur. Diese mtDNA-Daten liefern auch weitere Hinweise auf die Selektion der phänotypischen Unterschiede zwischen Dunkel und Hell. In der Pinacate-Population kann die Häufigkeit dunkler Mäuse auf hellem Substrat (9%) und die Häufigkeit dunkler Mäuse auf dunklem Substrat (89%) verwendet werden, um den Grad der Populationsdifferenzierung für phänotypische Unterschiede zwischen diesen beiden benachbarten Bereichen abzuschätzen . Dieser Wert ist > 10 mal größer als der entsprechende Wert für mtDNA , im Einklang mit der Idee, dass die Selektion die phänotypischen Unterschiede antreibt. Zukünftige Studien, die auf größeren Stichproben basieren und diesen Ansatz verwenden, werden es uns ermöglichen, das Ausmaß der Selektion anhand von Modellen des Migrations–Selektions-Gleichgewichts abzuschätzen.

Zweitens verursachen alle vier nicht-synonymen Substitutionen, die eine Assoziation mit der Fellfarbe zeigen, eine Änderung der Aminosäureladung. An den ersten drei Aminosäureseiten (18, 109, 160) erfolgt der Wechsel von einem positiv geladenen Arginin zu einer ungeladenen Aminosäure. An der vierten Stelle (233) wird ein ungeladenes Glutamin durch ein positiv geladenes Histidin ersetzt. Darüber hinaus befinden sich alle vier Mutationen in funktionell wichtigen Regionen des Rezeptors, die wahrscheinlich an Wechselwirkungen mit anderen Proteinen beteiligt sind. Zwei der Substitutionen befinden sich in extrazellulären Regionen (Aminosäurestellen 18 und 109) und zwei in intrazellulären Regionen (Stellen 160 und 233); keine befinden sich in Transmembrandomänen des Rezeptors (Abb. 3). Eine Reihe von zuvor beschriebenen dunklen Phänotypen am Verlängerungsort in der Maus (16) und anderen Organismen (21-25) sind auf einzelne Aminosäuremutationen in MC1R zurückzuführen, obwohl keine der hier beschriebenen Mutationen zuvor berichtet wurde. In der Labormaus werden die dunklen (Etob) und die dunklen (Eso) Verdunkelungsallele durch Mutationen in der ersten intrazellulären bzw. ersten extrazellulären Domäne verursacht. Etob kodiert für einen Melanocortin-1-Rezeptor, der auf α-Melanozyten-stimulierendes Hormon anspricht, aber hyperaktiv ist, während Eso für einen konstitutiv aktiven Rezeptor kodiert (16). Wie das Etob-Allel in Mus haben die hier berichteten Melanic C. intermedius eine dunkle Farbe, die auf das Dorsum beschränkt ist.

Drittens ist das dunkle Allel gegenüber dem hellen Allel dominant, was mit Beobachtungen von Mc1r-Mutationen in der Maus (11, 16) und anderen Organismen (21-25) übereinstimmt. In der Labormaus sind Loss-of-Function-Mutationen bei Mc1r rezessiv und führen zu heller Farbe, während Gain-of-Function-Allele dominant sind und zu dunkler Farbe führen (16). Alle heterozygoten Mäuse, die an der Pinacate-Stelle beobachtet wurden, sind dunkel mit ungebundenen Haaren und ähneln phänotypisch den homozygoten dunklen Mäusen.

Schließlich deutet das Muster der Nukleotidvariation, das unter Mc1r-Allelen von der Pinacate-Stelle beobachtet wurde, auf die jüngste Wirkung der positiven Selektion hin. Dreizehn polymorphe Stellen sind unter den hellen Haplotypen variabel, während nur eine Stelle unter den dunklen Haplotypen variabel ist (Tabelle 1). Das Verhältnis von Varianten zu invarianten Stellen unterscheidet sich signifikant zwischen dunklen und hellen Allelen (1/953 und 13/941, Fishers exakter Test, P < 0,01). Das durchschnittliche Niveau der Nukleotidvielfalt unter leichten Allelen (π = 0.21%) ist > 10-mal größer als die Nukleotiddiversität unter dunklen Allelen (π = 0,01%). Die reduzierte Variabilität unter den dunklen Mc1r-Allelen ist das erwartete Muster, wenn die Selektion kürzlich eine adaptive Substitution festgelegt hat (26-28). Eine einzelne stille Stelle (Nukleotid 633) befindet sich in einem vollständigen Verknüpfungsungleichgewicht mit den Aminosäuresubstitutionen, die bei allen dunklen Tieren vorhanden sind; Dieses Muster stimmt mit dem genetischen Trampen dieser stillen Stelle auf dem ausgewählten Haplotyp überein. Zwei Standardtests der Neutralität (29, 30) können jedoch keine Selektion auf Mc1r in der Pinakatenpopulation nachweisen, entweder in der Gesamtprobe oder in den Subpopulationen auf hellem oder dunklem Substrat. Der McDonald-Kreitman-Test (29) vergleicht das Verhältnis von synonymen zu nichtsynonymen Veränderungen innerhalb und zwischen Spezies; hier wird dieses Verhältnis nur geringfügig durch die vier Aminosäuresubstitutionen verändert, die die hellen und dunklen Mc1r-Allele unterscheiden. Der HKA-Test (30) vergleicht die Variation innerhalb und zwischen Spezies für zwei verschiedene Gene (in diesem Fall Mc1r und mtDNA); das Niveau der Nukleotidvariabilität bei Mc1r ist jedoch selbst in der Subpopulation auf dunklem Substrat aufgrund der Anwesenheit von Mc1r-Heterozygoten nicht signifikant reduziert.

Aufgrund des vollständigen Verknüpfungsungleichgewichts zwischen den Aminosäureseiten 18, 109, 160 und 233 (Tabelle 1) erlauben uns unsere Daten nicht, die relativen Beiträge jeder dieser Stellen zu den beobachteten Farbunterschieden zu bestimmen, noch schließen sie die Möglichkeit aus, dass ein verknüpftes Gen für beobachtete phänotypische Unterschiede verantwortlich ist. Die letztgenannte Möglichkeit erscheint aus den oben beschriebenen Gründen unwahrscheinlich und auch, weil weder beim Menschen noch bei Mus Pigmentierungskandidaten eng mit Mc1r verknüpft sind. In der Labormaus reichen einzelne Aminosäureänderungen an Mc1r aus, um eine dunkle Farbe zu erzeugen (16). Funktionelle Studien mit Mc1r-Konstrukten in einem In-vitro-Expressionssystem können verwendet werden, um die relative Wirkung der vier Mutationen auf die Aktivierung des Rezeptors zu messen. Vorläufige Ergebnisse von cAMP-Assays zeigen, dass das dunkle Allel einen hyperaktiven Rezeptor relativ zum hellen Allel kodiert, was die Rolle von Mc1r in den beobachteten phänotypischen Unterschieden stark unterstützt (H.E.H., H. Fujino, J. Regan und M.W.N., unveröffentlichte Daten). Mit diesem Ansatz mit Konstrukten, die jede der vier Mutationen einzeln und in Kombination enthalten, hoffen wir, zwischen zwei verschiedenen Modellen für die Mc1r-Evolution zu unterscheiden: (i) eine einzelne Aminosäurendifferenz ist für die beobachteten phänotypischen Unterschiede verantwortlich, und die anderen Aminosäurenvarianten sind mit der ausgewählten Stelle per Anhalter gefahren, oder (ii) zwei oder mehr Aminosäurenvarianten (additiv oder statisch wirkend) sind erforderlich, um die beobachteten phänotypischen Unterschiede zu erzeugen.

Auffallend ist, dass die hier vorgestellten Daten Aminosäureveränderungen bei Mc1r im dunklen Phänotyp in der Pinacate-Population, aber nicht in der Armendaris-Population implizieren. Unter den 40 Allelen aus Armendaris wurde nur ein Mc1r-Aminosäurepolymorphismus (Ala-285 → Thr) beobachtet; diese Variante war in 2 von 24 Allelen in hellen Mäusen und 0 von 16 Allelen in dunklen Mäusen vorhanden. Zwei stille Polymorphismen waren bei Zwischenfrequenzen (48%) unter den 40 Armendaris-Allelen vorhanden, zeigten jedoch keine Assoziation mit der Mausfarbe. Tatsächlich waren die Häufigkeiten dieser Polymorphismen bei dunklen (50%) und hellen (45%) Mäusen sehr ähnlich. Das Fehlen einer Assoziation zwischen Nukleotidpolymorphismen in der Mc1r-kodierenden Region und Mausfarbe bei Armendaris macht es auch unwahrscheinlich, dass nicht überwachte Stellen in der Promotorregion für die phänotypischen Unterschiede verantwortlich sind, es sei denn, das Verknüpfungsungleichgewicht zerfällt extrem schnell. Die Promotorregion von Mc1r wurde sowohl bei Mäusen (31) als auch beim Menschen (32) gut charakterisiert und liegt ≈500 bp stromaufwärts des Startcodons. Im Allgemeinen waren Muster der Nukleotidvariation in der codierenden Region von Mc1r in den Proben von Armendaris (sowohl hell als auch dunkel), Portal und Avra Valley nicht außergewöhnlich. Die Nukleotiddiversität lag zwischen 0,11% und 0,19%, ähnlich dem Wert, der für die leichten Tiere von der Pinacate-Stelle gesehen wurde.

Die Tatsache, dass die vier Mutationen, die in den Melanic Pinacate-Mäusen (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp und Gln-233 → His) beobachtet wurden, in den Melanic-Mäusen von Armendaris fehlen, deutet darauf hin, dass sich ein ähnlicher dunkler Phänotyp unabhängig von diesen verschiedenen Lavaströmen entwickelt hat und dies durch verschiedene genetische Veränderungen getan hat, obwohl das Gen (die Gene), die an der Armendaris-Population beteiligt sind, noch nicht identifiziert wurden. Die unterschiedliche molekulare Basis für den gleichen Phänotyp in zwei verschiedenen Populationen liefert starke Beweise für eine konvergente phänotypische Evolution auf einer relativ kurzen Zeitskala; Beide Lavaströme sind weniger als eine Million Jahre alt.

Während Mc1r-Verdunkelungsmutationen bei anderen Arten identifiziert wurden (16, 21-25), ist der ökologische Kontext für die Veränderungen entweder nicht verstanden (24, 25) oder auf künstliche Selektion zurückzuführen (22, 23). Eulen sind wichtige Raubtiere von Taschenmäusen (8, 9) und unterscheiden bekanntermaßen zwischen hellen und dunklen Mäusen auf hellen und dunklen Substraten, selbst wenn sie nachts bei geringer Lichtintensität nach Nahrung suchen (10). Daher ist es wahrscheinlich, dass Eulen eine wichtige Rolle bei der Auswahl spielen, um die Färbung zu verbergen. Die hier berichteten Daten sind ein seltenes Beispiel für die molekularen Veränderungen, die der Anpassung in einem einfachen und natürlichen ökologischen Umfeld zugrunde liegen.