A base genética do melanismo adaptativo em ratos de bolso

resultados e discussão

ratinhos foram recolhidos de seis locais em quatro regiões geográficas, incluindo substratos claros e escuros (Fig. 1A). Em todos os casos, observou-se uma estreita correspondência entre a cor do substrato e a cor da pelagem dorsal (Fig. 1B). Ratos de Portal e Vale de Avra eram uniformemente leves. Dos 29 ratos do local do Pinacato, 16 dos 18 ratos (89%) capturados na lava escura eram escuros, enquanto 10 dos 11 ratos (91%) capturados nas rochas de cor clara eram leves (Fig. 1B). Da mesma forma, dos 20 ratos de Armendaris, 7 de 8 ratos (88%) capturados na lava escura eram escuros, enquanto todos os 12 ratos (100%) capturados nas rochas de cor clara eram leves. Nestas populações, a variação fenotípica na cor era em grande parte discreta ao invés de quantitativa; todos os ratos eram facilmente classificados como luz ou melânico com base na presença ou ausência de uma banda subcterminal de feomelanina Em pelos individuais no dorsum.Em princípio, são possíveis várias abordagens para identificar os genes subjacentes a um fenótipo de interesse. No Entanto, C. intermedius são difíceis de reproduzir em cativeiro, e, portanto, qualquer abordagem que depende de cruzes não é prática. Em vez disso, usamos estudos de associação com genes candidatos para identificar mutações responsáveis pelas diferenças fenotípicas observadas. Aproximadamente 1,5 kb de DNA intrônico do agouti locus foram sequenciados em 36 ratos, incluindo representantes de todos os locais. A mutação black-and-tan no rato de laboratório produz um dorsum escuro com Pelos não polidos e é causada por uma inserção que perturba o promotor dorsal, ≈15 kb 5′ do códon de Início (15). Nós argumentamos que uma mutação similar em C. intermedius pode ser detectada através da ligação a polimorfismos em locais neutros em distâncias genômicas moderadas (0-50 kb, dependendo da Idade da mutação). Observamos 16 polimorfismos de nucleótidos únicos e 5 polimorfismos de inserção / deleção, incluindo vários em frequências intermediárias; nenhum mostrou uma associação com a cor da pelagem. Há duas explicações possíveis para esta falta de associação: Ou agouti não é um determinante principal das diferenças fenotípicas observadas, ou agouti está envolvido, mas há pouco ou nenhum desequilíbrio de ligação entre os locais pesquisados e o(s) Local (s) funcional (s).

ambos os alelos de todo o gene Mc1r (954 bp) foram sequenciados nos 69 ratinhos da Fig. 1. Vinte e quatro polimorfismos de nucleótidos únicos foram observados: 15 eram sinônimos e 9 não sinônimos. Quatro dos nove polimorfismos de aminoácidos foram observados apenas nos ratos escuros da localidade do Pinacato (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp, e Gln-233 → His). Estas quatro variantes de aminoácidos estavam presentes em alta frequência (82%) entre os ratos escuros do Pinacato e estavam em total desequilíbrio de ligação entre si. Todos os outros polimorfismos de aminoácidos Mc1r estavam presentes em baixas frequências e não mostraram associação com a cor do rato. A distribuição da variação do nucleótido Mc1r entre ratos leves e melânicos a partir do local do Pinacato é apresentada na Tabela 1.

várias observações sugerem que uma ou mais destas quatro mutações de aminoácidos (locais 18, 109, 160 e 233) são responsáveis pelas diferenças fenotípicas luz/escura observadas na população de Pinacatos. Primeiro, há uma associação perfeita entre genótipo e fenótipo (Tabela 2). Em uma única população panmática sem acasalamento sortativo, uma associação entre variação genotípica e fenotípica é inesperada a menos que o gene ou um gene estreitamente ligado seja responsável pelo fenótipo. No entanto, a estrutura populacional pode produzir uma associação espúria mesmo quando um gene não está envolvido nas diferenças fenotípicas (19). Testamos esta hipótese sequenciando os genes mitocondriais COIII e ND3 em todos os ratos a partir da localidade Pinacada (n = 29). Uma filogenia desses genes mitocondriais mostra que haplotipos de ratos claros e escuros são misturados, não fornecendo nenhuma evidência para estrutura populacional oculta (Fig. 2). Como a maior parte do fluxo genético no Chaetodipus é provavelmente mediado por machos (20) e porque o genoma mitocondrial tem um tamanho efectivo da população um quarto do tamanho efectivo dos autossomas, o DNA mitocondrial fornece um marcador sensível para detectar a estrutura da população. Estes dados mtDNA também fornecem provas adicionais da selecção das diferenças fenotípicas das trevas/luz. Na população de Pinacatos, a frequência de ratos escuros em substrato de luz (9%) e a frequência de ratos escuros em substrato escuro (89%) pode ser utilizada para estimar o grau de diferenciação populacional para diferenças fenotípicas entre estas duas áreas adjacentes . Este valor é >10 vezes maior do que o valor correspondente para mtDNA , consistente com a ideia de que a selecção está a conduzir as diferenças fenotípicas. Estudos futuros baseados em amostras maiores usando esta abordagem nos permitirão estimar a magnitude da seleção a partir de modelos de balanço de migração–seleção.

em segundo lugar, todas as quatro substituições não sinônimas que mostram uma associação com a cor do casaco causam uma mudança na carga de aminoácidos. Nos três primeiros locais de aminoácidos (18, 109, 160), a mudança é de uma arginina carregada positivamente para um aminoácido não carregado. No quarto local (233), uma glutamina não cobrada é substituída por uma histidina com carga positiva. Adicionalmente, todas as quatro mutações estão localizadas em regiões funcionalmente importantes do receptor que são susceptíveis de estar envolvidas em interacções com outras proteínas. Duas das substituições estão localizadas em regiões extracelulares (locais de aminoácidos 18 e 109) e duas estão localizadas em regiões intracelulares (locais 160 e 233).; nenhum está localizado em domínios transmembranares do receptor (Fig. 3). Um número de fenótipos escuros anteriormente descritos na extensão locus no ratinho (16) e outros organismos (21-25) são devidos a mutações de aminoácidos únicos na MC1R, embora nenhuma das mutações descritas aqui tenha sido anteriormente relatada. No rato de laboratório, o tabaco (Etob) e os alelos sombrios (Eso) são causados por mutações nos primeiros domínios intracelulares e extracelulares, respectivamente. O Etob codifica um receptor melanocortin-1 que permanece sensível à hormona estimuladora Dos α-melanócitos, mas é hiperactivo, enquanto o Eso codifica um receptor constitutivamente activo (16). Como o alelo Etob em Mus, o melanic C. intermedius relatado aqui tem cor escura restrita ao dorsum.

em terceiro lugar, o alelo escuro é dominante sobre o alelo de luz, consistente com observações de mutações Mc1r no rato (11, 16) e outros organismos (21-25). No rato de laboratório, mutações de perda de função em Mc1r são recessivas e resultam em cor clara, enquanto alelos de ganho de função são dominantes e resultam em cor escura (16). Todos os ratos heterozigóticos observados no local do Pinacato são escuros com Pelos não polidos e são fenotipicamente semelhantes aos ratos homozigóticos escuros.

finalmente, o padrão de variação de nucleótidos observado entre alelos Mc1r do local do Pinacato sugere a recente ação de seleção positiva. Treze locais polimórficos são variáveis entre os haplotipos leves, enquanto apenas um local é variável entre os haplotipos escuros (Tabela 1). A razão entre locais variantes e invariantes é significativamente diferente entre alelos escuros e luminosos (1/953 e 13/941, teste exato de Fisher, P < 0,01). O nível médio de diversidade de nucleótidos entre alelos de luz (π = 0.21%) é > 10 vezes maior do que a diversidade nucleotídica entre alelos escuros (π = 0,01%). A variabilidade reduzida observada entre os alelos MC1R escuros é o padrão esperado se a seleção tiver fixado recentemente uma substituição adaptativa (26-28). Um único local silencioso (nucleótido 633) está em total desequilíbrio de articulação com as substituições de aminoácidos presentes em todos os animais escuros; este padrão é consistente com a fixação genética deste local silencioso no haplótipo selecionado. No entanto, dois testes padrão de neutralidade (29, 30) não conseguem detectar a seleção em Mc1r na população de Pinacatos, seja na amostra total ou nas subpopulações em substrato claro ou escuro. O teste McDonald-Kreitman (29) compara a razão entre mudanças sinônimas e não sinônimas dentro e entre espécies; aqui, esta razão é alterada apenas ligeiramente pelas quatro substituições de aminoácidos que distinguem os alelos Mc1r claros e escuros. O teste HKA (30) compara a variação dentro e entre espécies para dois genes diferentes (neste caso, Mc1r e mtDNA); no entanto, o nível de variabilidade dos nucleótidos em Mc1r não é significativamente reduzido mesmo na subpopulação em substrato escuro, devido à presença de heterozigotos Mc1r.Por causa do desequilíbrio total entre os locais de aminoácidos 18, 109, 160 e 233 (Tabela 1), nossos dados não nos permitem determinar as contribuições relativas de cada um destes locais para as diferenças de cor observadas, nem descartam a possibilidade de que um gene ligado seja responsável pelas diferenças fenotípicas observadas. Esta última possibilidade parece improvável pelas razões acima descritas e também porque nenhum gene candidato de pigmentação está intimamente ligado ao Mc1r em seres humanos ou Mus. No rato de laboratório, as alterações de aminoácidos simples na Mc1r são suficientes para produzir uma cor escura (16). Estudos funcionais utilizando construções Mc1r num sistema de expressão in vitro podem ser utilizados para medir o efeito relativo das quatro mutações na activação do receptor. Resultados preliminares de ensaios de campo indicam que o alelo escuro codifica um receptor hiperativo em relação ao Alelo leve, fornecendo forte suporte para o papel de Mc1r nas diferenças fenotípicas observadas (H. E. H., H. Fujino, J. Regan e M. W. N., dados não publicados). Usando esta abordagem com construções que contêm cada uma das quatro mutações individualmente e em combinação, esperamos distinguir entre dois modelos diferentes para a evolução Mc1r: (i) uma única diferença de aminoácidos é responsável pelas diferenças fenotípicas observadas, e as outras variantes de aminoácidos têm problemas com o local selecionado, ou (ii) duas ou mais variantes de aminoácidos (agindo additivamente ou epistaticamente) são necessárias para produzir as diferenças fenotípicas observadas.Surpreendentemente, os dados aqui apresentados implicam alterações de aminoácidos em Mc1r no fenótipo escuro na população de Pinacatos, mas não na população de Armendaris. Apenas um polimorfismo dos aminoácidos Mc1r (Ala-285 → Thr) foi observado entre os 40 alelos de Armendaris; esta variante estava presente em 2 de 24 alelos em ratinhos leves e 0 de 16 alelos em ratinhos escuros. Dois polimorfismos silenciosos estavam presentes em frequências intermediárias (48%) entre os 40 armendaris aleles, mas nenhum mostrou qualquer associação com a cor do mouse. Na verdade, as frequências destes polimorfismos foram muito semelhantes entre ratos escuros (50%) e leves (45%). A ausência de uma associação entre os polimorfismos dos nucleótidos na região de codificação Mc1r e a cor do rato em Armendaris também torna improvável que os locais não atingidos na região promotora sejam responsáveis pelas diferenças fenotípicas, a menos que o desequilíbrio entre as ligações decaia muito rapidamente. A região promotora do Mc1r tem sido bem caracterizada em ratos (31) e humanos (32), e situa-se cerca de 500 bp a montante do codão inicial. Em geral, os padrões de variação nucleotídica na região de codificação de Mc1r nas amostras de Armendaris (luz e escuridão), Portal e Vale de Avra não foram excecionais. Os níveis de diversidade de nucleótidos variaram de 0,11% a 0,19%, semelhante ao valor observado para os animais leves do local do Pinacato.

O fato de que as quatro mutações visto no melânica Pinacate ratos (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp, e Gln-233 → Sua) estão ausentes no melânica, ratos de Armendaris indica que um semelhante escuro fenótipo tem evoluído de forma independente em relação a estes diferentes fluxos de lava e tem feito isso através de diferentes alterações genéticas, embora o gene(s) que participam na Armendaris população ainda não foram identificados. A base molecular distinta para o mesmo fenótipo em duas populações diferentes fornece fortes evidências de evolução fenotípica convergente em uma escala de tempo relativamente curta; ambos os fluxos de lava têm menos de um milhão de anos de idade.

enquanto as mutações de escurecimento Mc1r foram identificadas em outras espécies (16, 21-25), O contexto ecológico para as mudanças ou não é compreendido (24, 25) ou é devido à seleção artificial (22, 23). Corujas são predadores importantes de ratos de bolso (8, 9) e são conhecidos por discriminar entre ratos claros e escuros em substratos claros e escuros, mesmo quando forçam à noite sob baixa intensidade de luz (10). Assim, é provável que as corujas desempenhem um papel importante na seleção para ocultar a coloração. Os dados aqui relatados apresentam um exemplo raro das mudanças moleculares subjacentes à adaptação em um ambiente ecológico simples e natural.