De genetische basis van adaptief melanisme bij pocketmuizen

resultaten en discussie

muizen werden verzameld op zes plaatsen in vier geografische gebieden, waaronder zowel lichte als donkere substraten (Fig. 1 bis). In alle gevallen zagen we een nauwe overeenkomst tussen de substraatkleur en de kleur van het dorsale pelage (Fig. 1 ter). Muizen uit Portal en Avra vallei waren gelijkmatig licht. Van de 29 muizen van de Pinacate site waren 16 van de 18 muizen (89%) die op de donkere lava werden gevangen donker, terwijl 10 van de 11 muizen (91%) die op de lichtgekleurde rotsen werden gevangen licht waren (Fig. 1 ter). Van de 20 muizen uit Armendaris waren 7 van de 8 muizen (88%) die op de donkere lava werden gevangen donker, terwijl alle 12 muizen (100%) die op de lichtgekleurde rotsen werden gevangen licht waren. In deze populaties, fenotypische variatie in kleur was grotendeels discrete eerder dan kwantitatieve; alle muizen werden gemakkelijk geclassificeerd als licht of melanisch gebaseerd op de aanwezigheid of afwezigheid van een subterminale band van pheomelanine op individuele haren op het dorsum.

in principe zijn verschillende benaderingen mogelijk voor het identificeren van de genen die aan een bepaald fenotype ten grondslag liggen. Echter, C. intermedius zijn moeilijk te fokken in gevangenschap, en daarom elke benadering die afhankelijk is van kruisen is niet praktisch. In plaats daarvan gebruikten we associatiestudies met kandidaat-genen om mutaties te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de waargenomen fenotypische verschillen. Ongeveer 1,5 kb intronisch DNA van de agouti locus werd gesequenced in 36 muizen, met inbegrip van vertegenwoordigers van alle plaatsen. De zwart-bruine mutatie in de laboratoriummuis produceert een donker dorsum met ongebreidelde haren en wordt veroorzaakt door een insertie die de rugpromotor verstoort, ≈15 kb 5′ van het startcodon (15). We redeneerden dat een soortgelijke mutatie in C. intermedius zou kunnen worden gedetecteerd door koppeling aan polymorfismen op neutrale plaatsen over matige genomische afstanden (0-50 kb, afhankelijk van de leeftijd van de mutatie). We observeerden 16 single-nucleotide polymorfismen en 5 insertie / deletie polymorfismen, waaronder een aantal bij intermediaire frequenties; geen enkele vertoonde een associatie met de kleur van de vacht. Er zijn twee mogelijke verklaringen voor dit gebrek aan associatie: Of agouti is geen belangrijke determinant van de waargenomen fenotypische verschillen, of agouti is betrokken, maar er is weinig of geen samenhang onevenwichtigheid tussen de onderzochte sites en de functionele site(s).

beide allelen van het gehele MC1R-gen (954 bp) werden gesequenced bij de 69 muizen in Fig. 1. Vierentwintig single-nucleotide polymorfismen werden waargenomen: 15 waren synoniem en 9 waren niet-synoniem. Vier van de negen aminozuurpolymorfismen werden alleen waargenomen bij de donkere muizen vanaf de Pinacaatlocatie (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp, en Gln-233 → His). Deze vier aminozuurvarianten waren aanwezig bij hoge frequentie (82%) onder de Pinacate donkere muizen en waren in volledige samenhang onevenwichtig met elkaar. Alle andere Mc1r aminozuurpolymorfismen waren aanwezig bij lage frequenties en vertoonden geen associatie met muiskleur. De verdeling van de MC1R nucleotidevariatie onder lichte en melanic muizen van de plaats van het Pinacaat wordt getoond in Tabel 1.

verschillende observaties suggereren dat één of meer van deze vier aminozuurmutaties (locaties 18, 109, 160 en 233) verantwoordelijk zijn voor de fenotypische verschillen tussen licht en donker in de Pinacaatpopulatie. Ten eerste is er een perfecte associatie tussen genotype en fenotype (Tabel 2). In een enkele panmictische populatie zonder assortatieve paring is een associatie tussen genotypische en fenotypische variatie onverwacht, tenzij het gen of een nauw verbonden gen verantwoordelijk is voor het fenotype. Nochtans, kan de populatiestructuur een onechte vereniging veroorzaken zelfs wanneer een gen niet betrokken is bij de fenotypic verschillen (19). We hebben deze hypothese getest door de mitochondriale COIII-en ND3-genen te sequencen in alle muizen uit de Pinacaatlocatie (n = 29). Een fylogenie van deze mitochondriale genen toont aan dat haplotypes van lichte en donkere muizen worden vermengd, geen bewijs voor verborgen populatiestructuur (Fig. 2). Omdat de meeste genstroom in Chaetodipus waarschijnlijk door mannetjes (20) wordt bemiddeld en omdat het mitochondrial genoom een efficiënte populatiegrootte één kwart de efficiënte grootte van autosomes heeft, verstrekt mitochondrial DNA een gevoelige teller voor het ontdekken van populatiestructuur. Deze mtDNA gegevens verstrekken ook verder bewijsmateriaal van selectie op de donkere / lichte fenotypic verschillen. In de Pinacaatpopulatie kan de frequentie van donkere muizen op licht substraat (9%) en de frequentie van donkere muizen op donker substraat (89%) worden gebruikt om de mate van populatiedifferentiatie voor fenotypische verschillen tussen deze twee aangrenzende gebieden te schatten . Deze waarde is > 10 keer groter dan de overeenkomstige waarde voor mtDNA , in overeenstemming met het idee dat selectie aan de basis ligt van de fenotypische verschillen. Toekomstige studies op basis van grotere monsters met behulp van deze aanpak zullen ons in staat stellen om de omvang van de selectie uit modellen van migratie–selectie balans te schatten.

ten tweede, alle vier niet-synonieme substituties die een associatie met vachtkleur tonen veroorzaken een verandering in aminozuurlading. Op de eerste drie aminozuurplaatsen (18, 109, 160), is de verandering van positief geladen arginine aan een niet geladen aminozuur. Op de vierde plaats (233) wordt een niet-geladen glutamine vervangen door een positief geladen histidine. Bovendien, worden alle vier veranderingen gevestigd in functioneel belangrijke gebieden van de receptor die waarschijnlijk bij interactie met andere proteã nen worden betrokken. Twee van de substituties bevinden zich in extracellulaire gebieden (aminozuurplaatsen 18 en 109) en twee bevinden zich in intracellulaire gebieden (plaatsen 160 en 233); geen bevinden zich in transmembraandomeinen van de receptor (Fig. 3). Een aantal eerder beschreven donkere fenotypen op de extensieplaats bij de muis (16) en andere organismen (21-25) zijn het gevolg van enkelvoudige aminozuurmutaties in MC1R, hoewel geen van de hier beschreven mutaties eerder is gemeld. In de laboratoriummuis worden de tabak (Etob) en de sombere (Eso) darkening allelen veroorzaakt door mutaties in respectievelijk de eerste intracellulaire en de eerste extracellulaire domeinen. Etob codeert een melanocortine-1-receptor die responsief blijft op α-melanocyt-stimulerend hormoon maar hyperactief is, terwijl Eso codeert voor een constitutief actieve receptor (16). Net als het Etob-allel in Mus heeft de melanic C. intermedius die hier wordt gerapporteerd een donkere kleur die beperkt is tot het dorsum.

Ten derde is het donkere allel dominant over het lichte allel, consistent met waarnemingen van Mc1r mutaties bij de muis (11, 16) en andere organismen (21-25). In de laboratoriummuis zijn loss-of-function mutaties bij Mc1r recessief en resulteren in lichte kleur, terwijl gain-of-function allelen dominant zijn en resulteren in donkere kleur (16). Alle heterozygote muizen die op de Pinacaatplaats worden waargenomen, zijn donker met ongebreidelde haren en zijn fenotypisch vergelijkbaar met de homozygote donkere muizen.

ten slotte wijst het patroon van nucleotidevariatie waargenomen onder Mc1r allelen van de Pinacaatplaats op de recente werking van positieve selectie. Dertien polymorfe sites zijn variabel onder de lichte haplotypes, terwijl slechts één site variabel is onder de donkere haplotypes (Tabel 1). De verhouding tussen variante en invariante plaatsen is significant verschillend tussen donkere en lichte allelen (1/953 en 13/941, Fisher ‘ s exact test, P < 0,01). Het gemiddelde niveau van nucleotidediversiteit onder lichte allelen (π = 0.21%) is > 10 keer groter dan de nucleotidediversiteit onder donkere allelen (π = 0,01%). De verminderde variabiliteit gezien onder de donkere Mc1r allelen is het verwachte patroon als selectie onlangs een adaptieve substitutie heeft vastgesteld (26-28). Een enkele stille plaats (nucleotide 633) is volledig in verband met de aminozuursubstituties aanwezig in alle donkere Dieren; dit patroon is consistent met genetische lifting van deze stille plaats op het geselecteerde haplotype. Twee standaard neutraliteitstests (29, 30) slagen er echter niet in om selectie op Mc1r in de Pinacaatpopulatie te detecteren, hetzij in het totale Monster, hetzij in de subpopulaties op licht of donker substraat. De McDonald-Kreitman-test (29) vergelijkt de verhouding tussen synonieme en niet-synonieme veranderingen binnen en tussen soorten; hier wordt deze verhouding slechts lichtjes veranderd door de vier aminozuursubstituties die de lichte en donkere Mc1r allelen onderscheiden. De HKA-test (30) vergelijkt variatie binnen en tussen soorten voor twee verschillende genen (in dit geval Mc1r en mtDNA); nochtans, is het niveau van nucleotidevariabiliteit bij Mc1r niet beduidend verminderd zelfs in de subpopulatie op donker substraat, toe te schrijven aan de aanwezigheid van MC1R heterozygotes.

vanwege de volledige samenhang tussen de aminozuurlocaties 18, 109, 160 en 233 (Tabel 1), laten onze gegevens ons niet toe om de relatieve bijdragen van elk van deze sites aan de waargenomen kleurverschillen te bepalen, noch sluiten ze de mogelijkheid uit dat een gekoppeld gen verantwoordelijk is voor waargenomen fenotypische verschillen. Deze laatste mogelijkheid lijkt onwaarschijnlijk om de hierboven beschreven redenen en ook omdat er geen kandidaat pigmentatiegenen nauw verbonden zijn met Mc1r bij mensen of Mus. In de laboratoriummuis zijn enkele aminozuurveranderingen bij Mc1r voldoende om een donkere kleur te produceren (16). Functionele studies met behulp van Mc1r constructies in een in vitro expressiesysteem kunnen worden gebruikt om het relatieve effect van de vier mutaties op de activering van de receptor te meten. Voorlopige resultaten van cAMP assays geven aan dat het donkere allel codeert een hyperactieve receptor ten opzichte van het lichte allel, het verstrekken van sterke ondersteuning voor de rol van Mc1r in de waargenomen fenotypische verschillen (H. E. H., H. Fujino, J. Regan, en M. W. N., ongepubliceerde gegevens). Met behulp van deze benadering met constructies die elk van de vier mutaties afzonderlijk en in combinatie bevatten, hopen we onderscheid te maken tussen twee verschillende modellen voor Mc1r evolutie: (i) één enkel aminozuurverschil is verantwoordelijk voor de waargenomen fenotypische verschillen, en de andere aminozuurvarianten hebben gelift met de geselecteerde plaats, of (ii) twee of meer aminozuurvarianten (additief of epistatisch) zijn vereist om de waargenomen fenotypische verschillen te produceren.Opvallend is dat de hier gepresenteerde gegevens aminozuurveranderingen bij Mc1r impliceren in het donkere fenotype in de Pinacaatpopulatie, maar niet in de Armendarispopulatie. Slechts één Mc1r aminozuurpolymorfisme (Ala-285 → Thr) werd waargenomen onder de 40 allelen uit Armendaris; deze variant was aanwezig in 2 van de 24 allelen bij lichte muizen en 0 van de 16 allelen bij donkere muizen. Twee stille polymorfismen waren aanwezig bij tussenfrequenties (48%) onder de 40 Armendaris allelen, maar geen van beide vertoonde enige associatie met muiskleur. In feite waren de frequenties van deze polymorfismen zeer vergelijkbaar bij donkere (50%) en lichte (45%) muizen. De afwezigheid van een associatie tussen nucleotidepolymorfismen in het Mc1r codeergebied en muiskleur bij Armendaris maakt het ook onwaarschijnlijk dat niet-verkorte plaatsen in het promotorgebied verantwoordelijk zijn voor de fenotypische verschillen, tenzij het gebrek aan evenwicht tussen de verbindingen extreem snel vervalt. De promotor regio van Mc1r is goed gekarakteriseerd in zowel muizen (31) en mensen (32), en het ligt ≈500 bp stroomopwaarts van het startcodon. In het algemeen, patronen van nucleotidevariatie in het codeergebied van Mc1r in de steekproeven van Armendaris (zowel licht als donker), portaal, en Avra vallei waren unexceptional. De niveaus van nucleotidediversiteit varieerden van 0,11% tot 0,19%, gelijkend op de waarde die voor de lichte dieren van de Pinacateplaats wordt gezien.

het feit dat de vier mutaties in de melanische Pinacaatmuizen (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp, en Gln-233 → His) afwezig zijn in de melanische muizen uit Armendaris wijst erop dat een soortgelijk donker fenotype onafhankelijk van deze verschillende lavastromen is geëvolueerd en dit heeft gedaan door verschillende genetische veranderingen, hoewel de genen die betrokken zijn bij de Armendaris populatie nog niet zijn geïdentificeerd. De verschillende moleculaire basis voor hetzelfde fenotype in twee verschillende populaties levert sterk bewijs voor convergente fenotypische evolutie op een relatief korte tijdschaal; beide lavastromen zijn minder dan een miljoen jaar oud.

terwijl MC1R darkening mutaties zijn geïdentificeerd bij andere soorten (16, 21-25), wordt de ecologische context voor de veranderingen niet begrepen (24, 25) of is het gevolg van kunstmatige selectie (22, 23). Uilen zijn belangrijke roofdieren van zakmuizen (8, 9) en het is bekend dat ze onderscheid maken tussen lichte en donkere muizen op lichte en donkere substraten, zelfs wanneer ze ‘ s nachts onder lage lichtintensiteit foerageren (10). Het is dus waarschijnlijk dat uilen een belangrijke rol spelen bij het selecteren voor het verbergen van kleuring. De hier gerapporteerde gegevens geven een zeldzaam voorbeeld van de moleculaire veranderingen die aan adaptatie ten grondslag liggen in een eenvoudige en natuurlijke ecologische setting.