La base genética del melanismo adaptativo en ratones de bolsillo

Resultados y Discusión

Se recolectaron ratones de seis sitios en cuatro regiones geográficas, incluidos sustratos claros y oscuros (Fig. 1A). En todos los casos, se observó una estrecha coincidencia entre el color del sustrato y el color del pelaje dorsal (Fig. 1B). Los ratones de Portal y del Valle de Avra eran uniformemente ligeros. De los 29 ratones del sitio de Pinacate, 16 de 18 ratones (89%) atrapados en la lava oscura eran oscuros, mientras que 10 de 11 ratones (91%) atrapados en las rocas de color claro eran claros (Fig. 1B). De manera similar, de los 20 ratones de Armendaris, 7 de 8 ratones (88%) atrapados en la lava oscura eran oscuros, mientras que los 12 ratones (100%) atrapados en las rocas de color claro eran ligeros. En estas poblaciones, la variación fenotípica en el color fue en gran medida discreta en lugar de cuantitativa; todos los ratones se clasificaron fácilmente como ligeros o melánicos en función de la presencia o ausencia de una banda subterminal de feomelanina en pelos individuales en el dorso.

En principio, son posibles varios enfoques para identificar los genes subyacentes a un fenotipo de interés. Sin Embargo, C. los intermedios son difíciles de criar en cautiverio, y por lo tanto cualquier enfoque que se base en cruces no es práctico. En su lugar, utilizamos estudios de asociación con genes candidatos para identificar mutaciones responsables de las diferencias fenotípicas observadas. Se secuenciaron aproximadamente 1,5 kb de ADN intrónico del locus agutí en 36 ratones, incluidos representantes de todos los sitios. La mutación negra y bronceada en el ratón de laboratorio produce un dorso oscuro con pelos sin bandas y es causada por una inserción que interrumpe el promotor dorsal, ≈15 kb 5′ del codón de inicio (15). Razonamos que una mutación similar en C. intermedius podría detectarse a través de la vinculación a polimorfismos en sitios neutros a distancias genómicas moderadas (0-50 kb, dependiendo de la edad de la mutación). Se observaron 16 polimorfismos de un solo nucleótido y 5 polimorfismos de inserción/deleción, incluyendo varios a frecuencias intermedias; ninguno mostró asociación con el color de la capa. Hay dos posibles explicaciones para esta falta de asociación: O el agutí no es un determinante principal de las diferencias fenotípicas observadas, o el agutí está involucrado, pero hay poco o ningún desequilibrio de vinculación entre los sitios que estudiamos y el sitio o sitios funcionales.

Ambos alelos de todo el gen Mc1r (954 pb) fueron secuenciados en los 69 ratones de la Fig. 1. Se observaron veinticuatro polimorfismos de un solo nucleótido: 15 eran sinónimos y 9 no sinónimos. Cuatro de los nueve polimorfismos de aminoácidos se observaron solo en ratones oscuros de la localidad de Pinacate (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp y Gln-233 → His). Estas cuatro variantes de aminoácidos estaban presentes a alta frecuencia (82%) entre los ratones oscuros de Pinacato y estaban en completo desequilibrio de enlace entre sí. Todos los demás polimorfismos de aminoácidos Mc1r se presentaron a bajas frecuencias y no mostraron asociación con el color del ratón. La distribución de la variación de nucleótidos Mc1r entre ratones ligeros y melánicos del sitio de Pinacato se muestra en la Tabla 1.

Varias observaciones sugieren que una o más de estas cuatro mutaciones de aminoácidos (sitios 18, 109, 160 y 233) son responsables de las diferencias fenotípicas claras/oscuras observadas en la población de pinacatos. En primer lugar, existe una asociación perfecta entre genotipo y fenotipo (Tabla 2). En una sola población panmíctica sin apareamiento selectivo, una asociación entre la variación genotípica y fenotípica es inesperada a menos que el gen o un gen estrechamente vinculado sea responsable del fenotipo. Sin embargo, la estructura de la población puede producir una asociación espuria incluso cuando un gen no está involucrado en las diferencias fenotípicas (19). Probamos esta hipótesis secuenciando los genes COIII y ND3 mitocondriales en todos los ratones de la localidad de Pinacate (n = 29). Una filogenia de estos genes mitocondriales muestra que los haplotipos de ratones claros y oscuros se entremezclan, no proporcionando evidencia de estructura poblacional oculta (Fig. 2). Debido a que la mayor parte del flujo de genes en el Chaetodipus es probablemente mediado por hombres (20) y debido a que el genoma mitocondrial tiene un tamaño de población efectivo de un cuarto del tamaño efectivo de los autosomas, el ADN mitocondrial proporciona un marcador sensible para detectar la estructura de la población. Estos datos de ADNmt también proporcionan pruebas adicionales de selección de las diferencias fenotípicas oscuro/claro. En la población de pinacatos, la frecuencia de ratones oscuros en sustrato claro (9%) y la frecuencia de ratones oscuros en sustrato oscuro (89%) se pueden utilizar para estimar el grado de diferenciación de la población para las diferencias fenotípicas entre estas dos áreas adyacentes . Este valor es > 10 veces mayor que el valor correspondiente para el ADNmt, consistente con la idea de que la selección está impulsando las diferencias fenotípicas. Estudios futuros basados en muestras más grandes utilizando este enfoque nos permitirán estimar la magnitud de la selección a partir de modelos de equilibrio migración–selección.

En segundo lugar, las cuatro sustituciones no sinónimas que muestran una asociación con el color de la capa causan un cambio en la carga de aminoácidos. En los tres primeros sitios de aminoácidos (18, 109, 160), el cambio es de una arginina cargada positivamente a un aminoácido sin carga. En el cuarto sitio (233), una glutamina sin carga es reemplazada por una histidina cargada positivamente. Además, las cuatro mutaciones se localizan en regiones funcionalmente importantes del receptor que probablemente participen en interacciones con otras proteínas. Dos de las sustituciones se localizan en regiones extracelulares (sitios de aminoácidos 18 y 109) y dos se localizan en regiones intracelulares (sitios 160 y 233); ninguno se encuentra en los dominios transmembranarios del receptor (Fig. 3). Una serie de fenotipos oscuros previamente descritos en el locus de extensión en el ratón (16) y otros organismos (21-25) se deben a mutaciones de un solo aminoácido en MC1R, aunque ninguna de las mutaciones descritas aquí se ha reportado previamente. En el ratón de laboratorio, los alelos de oscurecimiento tabaco (Etob) y sombrío (Eso) son causados por mutaciones en los primeros dominios intracelulares y extracelulares, respectivamente. Etob codifica un receptor de melanocortina-1 que sigue respondiendo a la hormona estimulante de α-melanocitos, pero es hiperactivo, mientras que Eso codifica un receptor constitutivamente activo (16). Al igual que el alelo Etob en Mus, los melánicos C. intermedius reportados aquí tienen un color oscuro restringido al dorso.

En tercer lugar, el alelo oscuro es dominante sobre el alelo claro, consistente con las observaciones de mutaciones Mc1r en el ratón (11, 16) y otros organismos (21-25). En el ratón de laboratorio, las mutaciones de pérdida de función en Mc1r son recesivas y dan como resultado un color claro, mientras que los alelos de ganancia de función son dominantes y dan como resultado un color oscuro (16). Todos los ratones heterocigotos observados en el Pinacate sitio oscuro sin bandas con pelos y son fenotípicamente similares a los homocigotos oscuro ratones.

Finalmente, el patrón de variación de nucleótidos observado entre los alelos Mc1r del sitio de Pinacato sugiere la acción reciente de selección positiva. Trece sitios polimórficos son variables entre los haplotipos claros, mientras que solo un sitio es variable entre los haplotipos oscuros (Tabla 1). La relación entre la variante y los sitios invariantes es significativamente diferente entre los alelos oscuros y claros (1/953 y 13/941, prueba exacta de Fisher, P < 0.01). Nivel medio de diversidad de nucleótidos entre alelos ligeros (π = 0.21%) es > 10 veces mayor que la diversidad de nucleótidos entre alelos oscuros (π = 0,01%). La variabilidad reducida observada entre los alelos oscuros Mc1r es el patrón esperado si la selección ha fijado recientemente una sustitución adaptativa (26-28). Un único sitio silencioso (nucleótido 633) está en completo desequilibrio de enlace con las sustituciones de aminoácidos presentes en todos los animales oscuros; este patrón es consistente con el enganche genético de este sitio silencioso en el haplotipo seleccionado. Sin embargo, dos pruebas estándar de neutralidad (29, 30) no detectan la selección en Mc1r en la población de pinacatos, ya sea en la muestra total o en las subpoblaciones en sustrato claro u oscuro. La prueba de McDonald–Kreitman (29) compara la proporción de cambios sinónimos con cambios no sinónimos dentro y entre especies; aquí, esta proporción se cambia solo ligeramente por las cuatro sustituciones de aminoácidos que distinguen los alelos Mc1r claros y oscuros. La prueba de HKA (30) compara la variación dentro de las especies y entre ellas para dos genes diferentes (en este caso, Mc1r y ADNmt); sin embargo, el nivel de variabilidad de nucleótidos en Mc1r no se reduce significativamente incluso en la subpoblación en sustrato oscuro, debido a la presencia de heterocigotos Mc1r.

Debido al desequilibrio de enlace completo entre los sitios de aminoácidos 18, 109, 160 y 233 (Tabla 1), nuestros datos no nos permiten determinar las contribuciones relativas de cada uno de estos sitios a las diferencias de color observadas, ni descartan la posibilidad de que un gen vinculado sea responsable de las diferencias fenotípicas observadas. Esta última posibilidad parece poco probable por las razones descritas anteriormente y también porque no hay genes de pigmentación candidatos estrechamente vinculados a Mc1r en humanos o Mus. En el ratón de laboratorio, los cambios de un solo aminoácido en Mc1r son suficientes para producir un color oscuro (16). Los estudios funcionales que utilizan construcciones Mc1r en un sistema de expresión in vitro se pueden utilizar para medir el efecto relativo de las cuatro mutaciones en la activación del receptor. Los resultados preliminares de los ensayos cAMP indican que el alelo oscuro codifica un receptor hiperactivo en relación con el alelo claro, proporcionando un fuerte apoyo para el papel de Mc1r en las diferencias fenotípicas observadas (H. E. H., H. Fujino, J. Regan y M. W. N., datos no publicados). Usando este enfoque con construcciones que contienen cada una de las cuatro mutaciones individualmente y en combinación, esperamos distinguir entre dos modelos diferentes para la evolución de Mc1r: (i) una sola diferencia de aminoácidos es responsable de las diferencias fenotípicas observadas, y las otras variantes de aminoácidos han hecho autostop con el sitio seleccionado, o (ii) se requieren dos o más variantes de aminoácidos (que actúan aditiva o epistáticamente) para producir las diferencias fenotípicas observadas.

Sorprendentemente, los datos presentados aquí implican cambios de aminoácidos en Mc1r en el fenotipo oscuro en la población de Pinacatos, pero no en la población de Armendaris. Solo se observó un polimorfismo de aminoácidos Mc1r (Ala-285 → Thr) entre los 40 alelos de Armendaris; esta variante estaba presente en 2 de 24 alelos en ratones claros y 0 de 16 alelos en ratones oscuros. Dos polimorfismos silenciosos estaban presentes en frecuencias intermedias (48%) entre los 40 alelos Armendaris, pero ninguno mostró asociación alguna con el color del ratón. De hecho, las frecuencias de estos polimorfismos fueron muy similares entre ratones oscuros (50%) y claros (45%). La ausencia de una asociación entre los polimorfismos de nucleótidos en la región codificante de Mc1r y el color del ratón en Armendaris también hace poco probable que los sitios no analizados en la región promotora sean responsables de las diferencias fenotípicas, a menos que el desequilibrio de enlace se desintegre extremadamente rápidamente. La región promotora de Mc1r ha sido bien caracterizada tanto en ratones (31) como en humanos (32), y se encuentra ≈500 bp aguas arriba del codón de inicio. En general, los patrones de variación de nucleótidos en la región de codificación de Mc1r en las muestras de Armendaris (tanto claras como oscuras), Portal y Valle Avra no fueron excepcionales. Los niveles de diversidad de nucleótidos oscilaron entre 0,11% y 0,19%, similar al valor observado para los animales ligeros del sitio de Pinacato.

El hecho de que las cuatro mutaciones observadas en los ratones Pinacate melánicos (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp y Gln-233 → His) estén ausentes en los ratones melánicos de Armendaris indica que un fenotipo oscuro similar ha evolucionado de forma independiente en estos diferentes flujos de lava y lo ha hecho a través de diferentes cambios genéticos, aunque los genes involucrados en la población de Armendaris aún no se han identificado. La base molecular distinta para el mismo fenotipo en dos poblaciones diferentes proporciona una fuerte evidencia de la evolución fenotípica convergente en una escala de tiempo relativamente corta; ambos flujos de lava tienen menos de un millón de años.

Mientras que las mutaciones de oscurecimiento Mc1r se han identificado en otras especies (16, 21-25), el contexto ecológico de los cambios no se comprende (24, 25) o se debe a la selección artificial (22, 23). Los búhos son depredadores importantes de ratones de bolsillo (8, 9) y se sabe que discriminan entre ratones claros y oscuros en sustratos claros y oscuros, incluso cuando se alimentan de noche con poca intensidad de luz (10). Por lo tanto, es probable que los búhos desempeñen un papel importante en la selección para ocultar la coloración. Los datos aquí presentados presentan un raro ejemplo de los cambios moleculares subyacentes a la adaptación en un entorno ecológico simple y natural.