La base génétique du mélanisme adaptatif chez les souris de poche

Résultats et discussion

Les souris ont été collectées sur six sites dans quatre régions géographiques, y compris des substrats clairs et sombres (Fig. 1 BIS). Dans tous les cas, nous avons observé une correspondance étroite entre la couleur du substrat et la couleur du pelage dorsal (Fig. 1B). Les souris de Portal et de la vallée d’Avra étaient uniformément légères. Sur les 29 souris du site de Pinacate, 16 des 18 souris (89%) capturées sur la lave sombre étaient sombres, tandis que 10 des 11 souris (91%) capturées sur les roches de couleur claire étaient claires (Fig. 1B). De même, sur les 20 souris d’Armendaris, 7 des 8 souris (88%) capturées sur la lave sombre étaient sombres, tandis que les 12 souris (100%) capturées sur les roches de couleur claire étaient claires. Dans ces populations, la variation phénotypique de la couleur était en grande partie discrète plutôt que quantitative; toutes les souris étaient facilement classées comme légères ou mélaniques en fonction de la présence ou de l’absence d’une bande subterminale de phéomélanine sur les poils individuels du dos.

En principe, plusieurs approches sont possibles pour identifier les gènes sous-jacents à un phénotype d’intérêt. Cependant, C. les intermedius sont difficiles à reproduire en captivité et, par conséquent, toute approche reposant sur des croisements n’est pas pratique. Au lieu de cela, nous avons utilisé des études d’association avec des gènes candidats pour identifier les mutations responsables des différences phénotypiques observées. Environ 1,5 kb d’ADN intronique du locus agouti ont été séquencés chez 36 souris, y compris des représentants de tous les sites. La mutation noir et beige chez la souris de laboratoire produit un dos sombre avec des poils non bandés et est causée par une insertion perturbant le promoteur dorsal, ≈15 kb 5′ du codon de départ (15). Nous avons estimé qu’une mutation similaire chez C. intermedius pourrait être détectée par liaison à des polymorphismes à des sites neutres sur des distances génomiques modérées (0-50 kb, selon l’âge de la mutation). Nous avons observé 16 polymorphismes mononucléotidiques et 5 polymorphismes d’insertion/délétion, dont plusieurs à des fréquences intermédiaires; aucun n’a montré d’association avec la couleur du pelage. Il y a deux explications possibles à ce manque d’association: Soit l’agouti n’est pas un déterminant principal des différences phénotypiques observées, soit l’agouti est impliqué, mais il y a peu ou pas de déséquilibre de liaison entre les sites que nous avons étudiés et le ou les sites fonctionnels.

Les deux allèles de l’ensemble du gène Mc1r (954 pb) ont été séquencés chez les 69 souris de la Fig. 1. Vingt-quatre polymorphismes mononucléotidiques ont été observés : 15 étaient synonymes et 9 n’étaient pas synonymes. Quatre des neuf polymorphismes d’acides aminés n’ont été observés que chez les souris sombres de la localité de Pinacate (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp et Gln-233 → His). Ces quatre variantes d’acides aminés étaient présentes à haute fréquence (82%) chez les souris noires Pinacées et étaient en déséquilibre de liaison complet les unes avec les autres. Tous les autres polymorphismes d’acides aminés Mc1r étaient présents à des fréquences basses et n’ont montré aucune association avec la couleur de la souris. La distribution de la variation des nucléotides Mc1r parmi les souris légères et mélaniques du site Pinacate est présentée dans le tableau 1.

Plusieurs observations suggèrent qu’une ou plusieurs de ces quatre mutations d’acides aminés (sites 18, 109, 160 et 233) sont responsables des différences phénotypiques claires/sombres observées dans la population de Pinacés. Premièrement, il existe une association parfaite entre génotype et phénotype (tableau 2). Dans une seule population panmictique sans accouplement assorti, une association entre la variation génotypique et phénotypique est inattendue à moins que le gène ou un gène étroitement lié ne soit responsable du phénotype. Cependant, la structure de la population peut produire une association fausse même lorsqu’un gène n’est pas impliqué dans les différences phénotypiques (19). Nous avons testé cette hypothèse en séquençant les gènes mitochondriaux COIII et ND3 chez toutes les souris de la localité Pinacée (n = 29). Une phylogénie de ces gènes mitochondriaux montre que les haplotypes de souris claires et sombres sont entremêlés, ne fournissant aucune preuve de la structure cachée de la population (Fig. 2). Étant donné que la majeure partie du flux de gènes dans le Chaetodipe est probablement médiée par les mâles (20) et que le génome mitochondrial a une taille de population effective d’un quart de la taille effective des autosomes, l’ADN mitochondrial fournit un marqueur sensible pour détecter la structure de la population. Ces données d’ADNmt fournissent également des preuves supplémentaires de la sélection sur les différences phénotypiques sombres / claires. Dans la population de Pinacés, la fréquence des souris sombres sur substrat clair (9%) et la fréquence des souris sombres sur substrat sombre (89%) peuvent être utilisées pour estimer le degré de différenciation de la population pour les différences phénotypiques entre ces deux zones adjacentes. Cette valeur est > 10 fois plus grande que la valeur correspondante pour l’ADNmt, ce qui concorde avec l’idée que la sélection est à l’origine des différences phénotypiques. Des études futures basées sur des échantillons plus grands utilisant cette approche nous permettront d’estimer l’ampleur de la sélection à partir de modèles d’équilibre migration–sélection.

Deuxièmement, les quatre substitutions non synonymes qui montrent une association avec la couleur du pelage provoquent un changement de la charge en acides aminés. Aux trois premiers sites d’acides aminés (18, 109, 160), le changement passe d’une arginine chargée positivement à un acide aminé non chargé. Au quatrième site (233), une glutamine non chargée est remplacée par une histidine chargée positivement. De plus, les quatre mutations sont localisées dans des régions fonctionnellement importantes du récepteur susceptibles d’être impliquées dans des interactions avec d’autres protéines. Deux des substitutions sont situées dans des régions extracellulaires (sites d’acides aminés 18 et 109) et deux sont situées dans des régions intracellulaires (sites 160 et 233); aucun n’est situé dans les domaines transmembranaires du récepteur (Fig. 3). Un certain nombre de phénotypes sombres précédemment décrits au locus d’extension chez la souris (16) et d’autres organismes (21-25) sont dus à des mutations d’un seul acide aminé dans MC1R, bien qu’aucune des mutations décrites ici n’ait été rapportée précédemment. Chez la souris de laboratoire, les allèles d’assombrissement du tabac (Etob) et du sombre (Eso) sont causés par des mutations dans les premiers domaines intracellulaires et les premiers domaines extracellulaires, respectivement. Etob code un récepteur de la mélanocortine-1 qui reste sensible à l’hormone stimulant les α-mélanocytes mais est hyperactif, tandis que l’Eso code un récepteur constitutivement actif (16). Comme l’allèle Etob chez Mus, le C. intermedius mélanique signalé ici a une couleur foncée limitée au dos.

Troisièmement, l’allèle sombre est dominant sur l’allèle clair, ce qui concorde avec les observations de mutations Mc1r chez la souris (11, 16) et d’autres organismes (21-25). Chez la souris de laboratoire, les mutations de perte de fonction à Mc1r sont récessives et donnent une couleur claire, alors que les allèles de gain de fonction sont dominants et donnent une couleur foncée (16). Toutes les souris hétérozygotes observées au site du Pinacate sont foncées avec des poils non bandés et sont phénotypiquement similaires aux souris sombres homozygotes.

Enfin, le modèle de variation nucléotidique observé parmi les allèles Mc1r du site Pinacate suggère l’action récente de la sélection positive. Treize sites polymorphes sont variables chez les haplotypes clairs, alors qu’un seul site est variable chez les haplotypes foncés (tableau 1). Le rapport entre les sites variant et invariants est significativement différent entre les allèles foncés et clairs (1/953 et 13/941, test exact de Fisher, P< 0,01). Le niveau moyen de diversité nucléotidique parmi les allèles légers (π = 0.21%) est > 10 fois plus grande que la diversité nucléotidique parmi les allèles foncés (π = 0,01 %). La variabilité réduite observée parmi les allèles Mc1r sombres est le modèle attendu si la sélection a récemment fixé une substitution adaptative (26-28). Un seul site silencieux (nucléotide 633) est en déséquilibre de liaison complet avec les substitutions d’acides aminés présentes chez tous les animaux sombres; ce schéma est compatible avec l’auto-stop génétique de ce site silencieux sur l’haplotype sélectionné. Cependant, deux tests standard de neutralité (29, 30) ne permettent pas de détecter la sélection sur Mc1r dans la population de Pinacés, soit dans l’échantillon total, soit dans les sous-populations sur substrat clair ou sombre. Le test de McDonald-Kreitman (29) compare le rapport des changements synonymes et non synonymes au sein et entre les espèces; ici, ce rapport n’est modifié que légèrement par les quatre substitutions d’acides aminés qui distinguent les allèles Mc1r clair et foncé. Le test HKA (30) compare la variation au sein et entre les espèces pour deux gènes différents (dans ce cas, Mc1r et ADNmt); cependant, le niveau de variabilité nucléotidique à Mc1r n’est pas significativement réduit même dans la sous-population sur substrat sombre, en raison de la présence d’hétérozygotes Mc1r.

En raison du déséquilibre complet de la liaison entre les sites d’acides aminés 18, 109, 160 et 233 (tableau 1), nos données ne nous permettent pas de déterminer les contributions relatives de chacun de ces sites aux différences de couleur observées, ni d’exclure la possibilité qu’un gène lié soit responsable des différences phénotypiques observées. Cette dernière possibilité semble peu probable pour les raisons décrites ci-dessus et aussi parce qu’aucun gène de pigmentation candidat n’est étroitement lié au Mc1r chez l’homme ou le Mus. Chez la souris de laboratoire, des changements d’acides aminés simples à Mc1r sont suffisants pour produire une couleur foncée (16). Des études fonctionnelles utilisant des constructions Mc1r dans un système d’expression in vitro peuvent être utilisées pour mesurer l’effet relatif des quatre mutations sur l’activation du récepteur. Les résultats préliminaires des tests de l’AMPc indiquent que l’allèle sombre code un récepteur hyperactif par rapport à l’allèle clair, fournissant un fort soutien pour le rôle de Mc1r dans les différences phénotypiques observées (H.E.H., H. Fujino, J. Regan et M.W.N., données non publiées). En utilisant cette approche avec des constructions contenant chacune des quatre mutations individuellement et en combinaison, nous espérons distinguer deux modèles différents pour l’évolution de Mc1r: (i) une seule différence d’acides aminés est responsable des différences phénotypiques observées, et les autres variantes d’acides aminés ont fait de l’auto-stop avec le site sélectionné, ou (ii) deux variantes d’acides aminés ou plus (agissant de manière additive ou épistatique) sont nécessaires pour produire les différences phénotypiques observées.

De manière frappante, les données présentées ici impliquent des changements d’acides aminés à Mc1r dans le phénotype sombre de la population de Pinacates mais pas dans la population d’Armendaris. Un seul polymorphisme d’acide aminé Mc1r (Ala-285 → Thr) a été observé parmi les 40 allèles d’Armendaris; cette variante était présente dans 2 des 24 allèles chez la souris claire et 0 des 16 allèles chez la souris sombre. Deux polymorphismes silencieux étaient présents à des fréquences intermédiaires (48%) parmi les 40 allèles d’Armendaris, mais aucun n’a montré d’association avec la couleur de la souris. En fait, les fréquences de ces polymorphismes étaient très similaires chez les souris sombres (50%) et claires (45%). L’absence d’association entre les polymorphismes nucléotidiques dans la région codante du Mc1r et la couleur de la souris à Armendaris rend également peu probable que des sites non explorés dans la région promotrice soient responsables des différences phénotypiques, à moins que le déséquilibre de la liaison ne se désintègre extrêmement rapidement. La région promotrice de Mc1r a été bien caractérisée chez la souris (31) et l’homme (32), et elle se situe ≈500 pb en amont du codon de départ. En général, les modèles de variation des nucléotides dans la région codante de Mc1r dans les échantillons d’Armendaris (clair et sombre), Portal et Avra Valley n’étaient pas exceptionnels. Les niveaux de diversité nucléotidique variaient de 0,11 % à 0,19 %, ce qui était similaire à la valeur observée pour les animaux légers du site de Pinacate.

Le fait que les quatre mutations observées chez les souris mélaniques Pinacées (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp et Gln-233 → His) soient absentes chez les souris mélaniques d’Armendaris indique qu’un phénotype sombre similaire a évolué indépendamment sur ces différentes coulées de lave et l’a fait par différents changements génétiques, bien que le ou les gènes impliqués dans la population d’Armendaris n’aient pas encore été identifiés. La base moléculaire distincte du même phénotype dans deux populations différentes fournit des preuves solides de l’évolution phénotypique convergente sur une échelle de temps relativement courte; les deux coulées de lave ont moins d’un million d’années.

Alors que des mutations assombrissant Mc1r ont été identifiées chez d’autres espèces (16, 21-25), le contexte écologique des changements n’est pas compris (24, 25) ou est dû à une sélection artificielle (22, 23). Les chouettes sont d’importants prédateurs des souris à poches (8, 9) et sont connues pour faire la distinction entre les souris claires et foncées sur des substrats clairs et foncés, même lorsqu’elles butinent la nuit sous une faible intensité lumineuse (10). Ainsi, il est probable que les hiboux jouent un rôle important dans la sélection pour dissimuler la coloration. Les données rapportées ici présentent un exemple rare des changements moléculaires sous-jacents à l’adaptation dans un environnement écologique simple et naturel.