Definizione di Falsi Positivi Reazioni di Screening per il Virus dell’Epatite C Anticorpi

Nella routine quotidiana di laboratorio, una diagnosi affidabile dell’infezione da virus dell’epatite C (HCV) non è sempre possibile con l’uso esclusivo di un saggio immunoenzimatico HCV (EIA), poiché è noto che per un certo numero di pazienti questo saggio produce risultati falsi positivi (4, 8, 17). Pertanto, i risultati ottenuti dalla VIA devono essere confermati da ulteriori test. Tuttavia, il saggio disponibile in commercio RIBA 2.0 (Chiron Corporation) non soddisfa i criteri che definiscono un saggio di conferma poiché è costituito da proteine ricombinanti identiche a quelle della VIA (1, 5, 9). La PCR HCV non può essere utilizzata per confermare i risultati positivi della VIA, poiché un risultato negativo della PCR non esclude la possibilità di infezione da HCV con viremia a basso livello (al di sotto del limite di rilevazione). Inoltre, la PCR è troppo laboriosa e costosa per essere utilizzata regolarmente come test di conferma. Pertanto, abbiamo stabilito un test immunoblot strip HCV (SIA) (Universitäts-Krankenhaus Eppendorf SIA) costituito da quattro proteine ricombinanti, derivate dal nucleo e tre regioni non strutturali (NS3, NS4 e NS5) di HCV, che sono diverse da quelle utilizzate nell’HCV EIA (5).

Nel presente studio abbiamo confrontato i risultati di una VIA HCV di seconda generazione con quelli dell’UKE SIA per 2.283 campioni di siero. L’obiettivo era quello di valutare l’importanza dei risultati positivi nella VIA HCV per definire i criteri per l’esecuzione di ulteriori test per diagnosticare in modo affidabile l’infezione da HCV nella routine quotidiana di laboratorio. I Sieri sono stati prelevati da 2.283 persone che vivono nella Germania settentrionale intorno alla città di Amburgo. Sono stati inviati al nostro laboratorio sotto il sospetto di infezione da HCV a causa di elevati valori degli enzimi epatici (alanina aminotransferasi, >45 U/litro) o segni clinici di epatite (ittero e dolore addominale superiore) o fattori di rischio per le malattie trasmesse per via parenterale, come emodialisi cronica, trasfusione di sangue, o uso di droghe per via endovenosa. Al momento dell’indagine sono risultati negativi per l’infezione acuta con HAV (anticorpi anti-HAV immunoglobulina M) e HBV (antigene di superficie dell’epatite B). Gli esami ripetuti sono stati eseguiti come follow-up ogni 3 mesi per 1 anno. Per lo screening sierologico una via HCV di seconda generazione (Abbott Laboratories, North Chicago, Ill.) è stato eseguito. Per la conferma dei risultati di HCV VIA, i sieri sono stati testati in parallelo dall’UKE SIA come descritto in precedenza (5). Il test immunoblot è stato considerato positivo quando sono stati rilevati anticorpi ad almeno due diverse proteine ricombinanti. La reattività contro solo una singola proteina è stata valutata come un risultato indeterminato. Per il rilevamento di HCV RNA la trascrizione inversa-PCR è stata eseguita come descritto in precedenza (6, 7).

La VIA HCV è risultata negativa per 469 campioni, di cui 456 (97%) sono risultati negativi anche da UKE SIA. Per 13 campioni l’UKE SIA è stato considerato indeterminato. Tutti i 469 di questi sieri sono risultati negativi alla PCR HCV e nessuno dei pazienti ha sviluppato segni clinici o biochimici di epatite durante il follow-up.

L’HCV EIA è risultato reattivo per 1.814 campioni, di cui 1.394 (77%) sono risultati positivi anche dall’UKE SIA (Tabella 1). Tuttavia, in 240 casi (13%) la reattività nella VIA HCV non ha potuto essere confermata da UKE SIA. Per 193 di questi 240 campioni erano disponibili campioni idonei per la PCR HCV e un risultato positivo della PCR è stato ottenuto con 13 campioni. Di questi, nove sono diventati positivi da UKE SIA quando nuovamente testati dopo 3 mesi, il che suggerisce che questi pazienti avevano acquisito l’infezione da HCV poco prima del primo esame. Nei restanti quattro pazienti, che hanno ripetutamente testato la PCR positiva nonostante un risultato negativo di UKE SIA, sono state riscontrate condizioni di immunosoppressione. Uno aveva un linfoma a cellule B, uno era cronicamente emodializzato e due praticavano l’uso di droghe per via endovenosa. È stato dimostrato in precedenza che nei pazienti con condizioni immunosoppressive, la risposta sierologica è bassa o addirittura assente (10, 14, 15). Ciò potrebbe portare a risultati negativi o indeterminati in saggi sierologici anche se l’individuo soffre di infezione da HCV (13). Pertanto, per i pazienti con disturbi immunosoppressivi noti, la PCR deve sempre essere eseguita. I 180 soggetti inizialmente negativi alla PCR sono rimasti negativi da UKE SIA e HCV PCR in ripetuti esami durante il follow-up. Inoltre, questi pazienti non hanno sviluppato segni clinici o biochimici di epatite. Ciò indica che in almeno questi 180 campioni (10%) si sono verificati risultati falsi positivi. Dobbiamo supporre che l’EIA fosse anche falso positivo nei campioni per i quali non era disponibile materiale adatto per la PCR, poiché l’UKE SIA è rimasto negativo e nessuno dei pazienti ha sviluppato segni clinici o biochimici di epatite durante il follow-up. Ciò indica che finché non sono disponibili in commercio saggi di screening migliori, ogni risultato positivo di HCV VIA deve essere confermato.

Un risultato indeterminato nell’UKE SIA è stato osservato con 180 dei 1.814 campioni positivi all’EIA (10%). Campioni adatti per HCV PCR sono stati ottenuti per 134 di questi 180 campioni, e HCV RNA potrebbe essere rilevato in 58 di loro. Durante il follow-up è stata osservata sieroconversione completa in quattro pazienti. Tutti inizialmente hanno rivelato anticorpi diretti esclusivamente contro la proteina NS3 dell’UKE SIA. Nei campioni di follow-up è emersa la reattività nei confronti di ulteriori proteine ricombinanti. Questi risultati supportano la precedente ipotesi che la reattività anticorpale contro NS3 giochi un ruolo importante nella diagnosi sierologica precoce dell’infezione da HCV (5). Inoltre, è stata trovata una correlazione particolarmente elevata tra viremia HCV e reattività anticorpale contro l’antigene c33c della RIBA disponibile in commercio (2). I campioni con un risultato positivo da HCV EIA e un risultato indeterminato da immunoblot devono essere sottoposti a PCR, poiché abbiamo rilevato HCV RNA nel 43% dei campioni (58 di 134). La percentuale di risultati indeterminati dall’UKE SIA è notevolmente bassa rispetto a quella di RIBA 2.0 o 3.0 (2, 3, 11, 16). Una ragione di ciò potrebbe essere che gli isolati locali sono stati utilizzati per stabilire l’UKE SIA, poiché i test sierologici contenenti proteine ricombinanti di isolati locali hanno dimostrato di avere una migliore sensibilità e specificità rispetto ai test disponibili in commercio (5, 12). Tuttavia, è improbabile che questa sia l’unica ragione, poiché l’UKE SIA è stato valutato con campioni di siero contenenti una varietà di genotipi HCV come descritto in precedenza (5).

La diagnosi HCV positiva ha un profondo impatto sulla vita della persona afflitta. Pertanto, deve essere raggiunto nel modo più affidabile possibile. I nostri dati indicano che l’HCV VIA ampiamente utilizzato produce un’alta percentuale (10%) di risultati falsi positivi. Rispetto ad altri test di screening, ad esempio il virus dell’immunodeficienza umana EIAs, questo è inaccettabilmente alto. Pertanto, la conferma di ogni risultato positivo di HCV VIA mediante test supplementari è obbligatoria. Come abbiamo dimostrato con il nostro UKE SIA interno, una possibilità per migliorare l’affidabilità della diagnosi HCV è di introdurre proteine nel test di conferma che sono diverse da quelle utilizzate nel test di screening.