Den genetiska grunden för adaptiv melanism i fickmöss

resultat och diskussion

möss samlades in från sex platser i fyra geografiska regioner, inklusive både ljusa och mörka substrat (Fig. 1A). I alla fall observerade vi en nära matchning mellan substratfärg och färgen på dorsal pelage (Fig. 1B). Möss från Portal och Avra Valley var jämnt ljusa. Av de 29 mössen från Pinacate-platsen var 16 av 18 möss (89%) fångade på den mörka lavan mörka, medan 10 av 11 möss (91%) fångade på de ljusa stenarna var ljusa (Fig. 1B). På samma sätt av de 20 mössen från Armendaris var 7 av 8 möss (88%) som fångats på den mörka lavan mörka, medan alla 12 möss (100%) som fångats på de ljusa klipporna var ljusa. I dessa populationer var fenotypisk variation i färg till stor del diskret snarare än kvantitativ; alla möss klassificerades lätt som ljus eller melanisk baserat på närvaron eller frånvaron av ett subterminalt band av pheomelanin på enskilda hårstrån på dorsum.

i princip är flera tillvägagångssätt möjliga för att identifiera generna som ligger bakom en fenotyp av intresse. Men C. intermedius är svåra att odla i fångenskap, och därför är alla tillvägagångssätt som bygger på kors inte praktiska. Istället använde vi associeringsstudier med kandidatgener för att identifiera mutationer som är ansvariga för de observerade fenotypiska skillnaderna. Cirka 1,5 kb introniskt DNA från agouti locus sekvenserades i 36 möss, inklusive representanter från alla platser. Den svarta och solbränna mutationen i laboratoriemusen producerar en mörk dorsum med obandade hår och orsakas av en insättning som stör dorsalpromotorn, 15 kb 5′ av startkodonet (15). Vi resonerade att en liknande mutation i C. intermedius kan detekteras genom koppling till polymorfismer vid neutrala ställen över måttliga genomiska avstånd (0-50 kb, beroende på mutationens ålder). Vi observerade 16 enkelnukleotidpolymorfismer och 5 insättnings – /deletionspolymorfismer, inklusive flera vid mellanfrekvenser; ingen visade ett samband med pälsfärg. Det finns två möjliga förklaringar till denna brist på förening: Antingen agouti är inte en huvuddeterminant av de observerade fenotypiska skillnaderna, eller agouti är involverad men det finns liten eller ingen koppling obalans mellan de platser vi undersökte och den funktionella platsen(s).

båda allelerna av hela Mc1r-genen (954 bp) sekvenserades i de 69 mössen i Fig. 1. Tjugofyra enkelnukleotidpolymorfismer observerades: 15 var synonyma och 9 Var icke-synonyma. Fyra av de nio aminosyrapolymorfismerna observerades endast i de mörka mössen från Pinacate-lokaliteten (Arg-18 msk Cys, Arg-109 kr Trp, Arg-160 kr Trp och Gln-233 kr His). Dessa fyra aminosyravarianter var närvarande vid hög frekvens (82%) bland de mörka mössen i Pinakat och var i fullständig koppling obalans med varandra. Alla andra Mc1r-aminosyrapolymorfismer var närvarande vid låga frekvenser och visade ingen association med musfärg. Fördelningen av Mc1r-nukleotidvariation bland ljus-och melaniska möss från Pinakatstället visas i Tabell 1.

Flera observationer tyder på att en eller flera av dessa fyra aminosyramutationer (platser 18, 109, 160 och 233) är ansvariga för de ljusa/mörka fenotypiska skillnaderna som ses i Pinakatpopulationen. För det första finns det en perfekt koppling mellan genotyp och fenotyp (Tabell 2). I en enda panmiktisk population utan assortativ parning är en koppling mellan genotypisk och fenotypisk variation oväntad såvida inte genen eller en tätt kopplad gen är ansvarig för fenotypen. Befolkningsstrukturen kan emellertid producera en falsk förening även när en gen inte är involverad i de fenotypiska skillnaderna (19). Vi testade denna hypotes genom att sekvensera mitokondriella COIII-och ND3-gener i alla möss från Pinacate-lokaliteten (n = 29). En fylogeni av dessa mitokondriella gener visar att haplotyper från ljusa och mörka möss blandas, vilket inte ger några bevis för dold befolkningsstruktur (Fig. 2). Eftersom de flesta genflödet i Chaetodipus sannolikt förmedlas av män (20) och eftersom mitokondriella genomet har en effektiv populationsstorlek en fjärdedel av den effektiva storleken på autosomer, ger mitokondriellt DNA en känslig markör för detektering av befolkningsstruktur. Dessa mtDNA-data ger också ytterligare bevis på val på de mörka/ljusa fenotypiska skillnaderna. I Pinakatpopulationen kan frekvensen av mörka möss på ljust substrat (9%) och frekvensen av mörka möss på mörkt substrat (89%) användas för att uppskatta graden av populationsdifferentiering för fenotypiska skillnader mellan dessa två intilliggande områden . Detta värde är >10 gånger större än motsvarande värde för mtDNA , i överensstämmelse med tanken att valet driver de fenotypiska skillnaderna. Framtida studier baserade på större prover med hjälp av detta tillvägagångssätt kommer att göra det möjligt för oss att uppskatta storleken på urvalet från modeller av migration–urvalsbalans.

för det andra orsakar alla fyra icke-synonyma substitutioner som visar en association med pälsfärg en förändring i aminosyraladdning. Vid de första tre aminosyraställena (18, 109, 160) är förändringen från en positivt laddad arginin till en oladdad aminosyra. På den fjärde platsen (233) ersätts en oladdad glutamin med en positivt laddad histidin. Dessutom finns alla fyra mutationer i funktionellt viktiga regioner i receptorn som sannolikt kommer att vara involverade i interaktioner med andra proteiner. Två av substitutionerna finns i extracellulära regioner (aminosyraställen 18 och 109) och två finns i intracellulära regioner (platser 160 och 233); ingen finns i receptorns transmembrandomäner (Fig. 3). Ett antal tidigare beskrivna mörka fenotyper vid förlängningslokalen i musen (16) och andra organismer (21-25) beror på enstaka aminosyramutationer i MC1R, även om ingen av de mutationer som beskrivs här tidigare har rapporterats. I laboratoriemusen orsakas tobaken (Etob) och de dystra (Eso) mörkare allelerna av mutationer i de första intracellulära respektive första extracellulära domänerna. Etob kodar för en melanokortin-1-receptor som förblir lyhörd för Millenium-melanocytstimulerande hormon men är hyperaktiv, medan Eso kodar för en konstitutivt aktiv receptor (16). Liksom Etob-allelen i Mus, melanic C. intermedius rapporterade här har mörk färg begränsad till dorsum.

för det tredje dominerar den mörka allelen över den ljusa allelen, i överensstämmelse med observationer av Mc1r-mutationer i musen (11, 16) och andra organismer (21-25). I laboratoriemusen är funktionsförlustmutationer vid Mc1r recessiva och resulterar i ljus färg, medan gain-of-function alleler dominerar och resulterar i mörk färg (16). Alla heterozygota möss som observeras på Pinakatplatsen är mörka med obandade hår och liknar fenotypiskt de homozygota mörka mössen.

slutligen föreslår mönstret av nukleotidvariation observerad bland Mc1r-alleler från Pinakatstället den senaste åtgärden av positivt urval. Tretton polymorfa ställen är variabla bland de ljusa haplotyperna, medan endast en plats är variabel bland de mörka haplotyperna (Tabell 1). Förhållandet mellan variant och invarianta platser är signifikant olika mellan mörka och ljusa alleler (1/953 och 13/941, Fishers exakta test, P < 0,01). Den genomsnittliga nivån av nukleotiddiversitet bland lätta alleler(0.21%) är > 10 gånger större än nukleotiddiversitet bland mörka alleler (0,01%). Den minskade variationen som ses bland de mörka Mc1r-allelerna är det förväntade mönstret om valet nyligen har fixat en adaptiv substitution (26-28). En enda tyst plats (nukleotid 633) är i fullständig koppling obalans med aminosyrasubstitutioner närvarande i alla Mörka djur; detta mönster är förenligt med genetisk hitchhiking av denna tysta plats på den valda haplotypen. Två standardtester av neutralitet (29, 30) misslyckas dock med att upptäcka val på Mc1r i Pinacate-populationen, antingen i det totala provet eller i subpopulationerna på ljus eller mörkt substrat. McDonald-Kreitman-testet (29) jämför förhållandet mellan synonymt med icke-synonyma förändringar inom och mellan arter; här ändras detta förhållande endast något av de fyra aminosyrasubstitutionerna som skiljer de ljusa och mörka Mc1r-allelerna. HKA-testet (30) jämför variation inom och mellan arter för två olika gener (i detta fall Mc1r och mtDNA); nivån av nukleotidvariabilitet vid Mc1r reduceras emellertid inte signifikant även i subpopulationen på mörkt substrat på grund av närvaron av Mc1r-heterozygoter.

på grund av fullständig obalans mellan aminosyraställen 18, 109, 160 och 233 (Tabell 1) tillåter våra data inte oss att bestämma de relativa bidragen från var och en av dessa platser till de observerade skillnaderna i färg, och de utesluter inte heller möjligheten att en länkad gen är ansvarig för observerade fenotypiska skillnader. Den senare möjligheten verkar osannolik av de skäl som beskrivs ovan och också för att inga kandidatpigmenteringsgener är nära kopplade till Mc1r hos antingen människor eller Mus. I laboratoriemusen är enstaka aminosyraförändringar vid Mc1r tillräckliga för att producera en mörk färg (16). Funktionella studier som använder Mc1r-konstruktioner i ett in vitro-expressionssystem kan användas för att mäta den relativa effekten av de fyra mutationerna på aktiveringen av receptorn. Preliminära resultat från cAMP-analyser indikerar att den mörka allelen kodar för en hyperaktiv receptor i förhållande till ljusallelen, vilket ger starkt stöd för Mc1rs roll i de observerade fenotypiska skillnaderna (H. E. H., H. Fujino, J. Regan och M. W. N., opublicerade data). Med hjälp av detta tillvägagångssätt med konstruktioner som innehåller var och en av de fyra mutationerna individuellt och i kombination hoppas vi kunna skilja mellan två olika modeller för Mc1r-evolution: (i) en enda aminosyraskillnad är ansvarig för de observerade fenotypiska skillnaderna, och de andra aminosyravarianterna har liftat med det valda stället, eller (ii) två eller flera aminosyravarianter (verkar additivt eller epistatiskt) krävs för att producera de observerade fenotypiska skillnaderna.

påfallande, de data som presenteras här implicerar aminosyraförändringar vid Mc1r i den mörka fenotypen i Pinakatpopulationen men inte i Armendaris-populationen. Endast en Mc1r-aminosyrapolymorfism (Ala-285 Bisexual Thr) observerades bland de 40 allelerna från Armendaris; denna variant var närvarande i 2 av 24 alleler i lätta Möss och 0 av 16 alleler i mörka möss. Två tysta polymorfier var närvarande vid mellanfrekvenser (48%) bland de 40 Armendaris-allelerna, men ingen av dem visade någon koppling till musfärg. Faktum är att frekvenserna för dessa polymorfismer var mycket lika bland mörka (50%) och ljusa (45%) möss. Frånvaron av en koppling mellan nukleotidpolymorfismer i Mc1r-kodningsregionen och musfärg vid Armendaris gör det också osannolikt att osurveyerade platser i promotorregionen är ansvariga för de fenotypiska skillnaderna, såvida inte kopplingsjämvikt sönderfaller extremt snabbt. Promotorregionen för Mc1r har varit väl karakteriserad i både möss (31) och människor (32), och det ligger 500 BP i 500 BP uppströms om startkodonet. I allmänhet mönster av nukleotidvariation i kodningsområdet för Mc1r i proverna från Armendaris (både ljus och mörk), Portal och Avra Valley var oexceptionella. Nivåer av nukleotiddiversitet varierade från 0,11% till 0,19%, liknande det värde som ses för de lätta djuren från Pinacate-platsen.

det faktum att de fyra mutationerna som ses i de melaniska Pinakatmössen (Arg-18 msk Cys, Arg-109 kr Trp, Arg-160 kr Trp och Gln-233 kr His) saknas i de melaniska mössen från Armendaris indikerar att en liknande mörk fenotyp har utvecklats oberoende på dessa olika lavaflöden och har gjort det genom olika genetiska förändringar, även om genen / generna som är involverade i Armendarispopulationen ännu inte har identifierats. Den distinkta molekylära grunden för samma fenotyp i två olika populationer ger starka bevis för konvergent fenotypisk utveckling på en relativt kort tidsskala; båda lavaflödena är mindre än en miljon år gamla.

medan Mc1r-mörkningsmutationer har identifierats i andra arter (16, 21-25), är det ekologiska sammanhanget för förändringarna antingen inte förstått (24, 25) eller beror på artificiellt urval (22, 23). Ugglor är viktiga rovdjur av fickmöss (8, 9) och är kända för att skilja mellan ljusa och mörka möss på ljusa och mörka substrat även vid födosök på natten under låg ljusintensitet (10). Således är det troligt att ugglor spelar en viktig roll för att välja för att dölja färg. De data som rapporteras här presenterar ett sällsynt exempel på de molekylära förändringar som ligger bakom anpassningen i en enkel och naturlig ekologisk miljö.