Det genetiske grundlag for adaptiv melanisme i lommemus

resultater og diskussion

mus blev samlet fra seks steder i fire geografiske regioner, herunder både lyse og mørke substrater (Fig. 1A). I alle tilfælde observerede vi en tæt match mellem substratfarve og farven på dorsal pelage (Fig. 1B). Mus fra Portal og Avra Valley var ensartet lette. Af de 29 mus fra Pinacatstedet var 16 af 18 mus (89%) fanget på den mørke lava mørke, mens 10 af 11 mus (91%) fanget på de lyse klipper var lette (Fig. 1B). Tilsvarende af de 20 mus fra Armendaris var 7 af 8 mus (88%) fanget på den mørke lava mørke, mens alle 12 mus (100%) fanget på de lyse klipper var lyse. I disse populationer var fænotypisk variation i farve stort set diskret snarere end kvantitativ; alle mus blev let klassificeret som lys eller melanisk baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af et subterminalt bånd af pheomelanin på individuelle hår på dorsum.

i princippet er flere tilgange mulige til at identificere de gener, der ligger til grund for en fænotype af interesse. C. intermedius er vanskelige at opdrætte i fangenskab, og derfor er enhver tilgang, der er afhængig af kryds, ikke praktisk. I stedet brugte vi associeringsundersøgelser med kandidatgener til at identificere mutationer, der var ansvarlige for de observerede fænotypiske forskelle. 1,5 kb intronisk DNA fra agouti locus blev sekventeret i 36 mus, herunder repræsentanter fra alle steder. Sort-og-tan-mutationen i laboratoriemusen producerer en mørk dorsum med ubåndede hår og er forårsaget af en indsættelse, der forstyrrer dorsalpromotoren, venstre 15 kb 5′ af startkodonet (15). Vi begrundede, at en lignende mutation i C. intermedius kunne detekteres gennem binding til polymorfier på neutrale steder over moderate genomiske afstande (0-50 kb, afhængigt af mutationens alder). Vi observerede 16 polymorfier med enkelt nukleotid og 5 indsætnings-/deletionspolymorfier, inklusive flere ved mellemfrekvenser; ingen viste en tilknytning til frakkefarve. Der er to mulige forklaringer på denne manglende tilknytning: Enten er agouti ikke en hoveddeterminant for de observerede fænotypiske forskelle, eller agouti er involveret, men der er ringe eller ingen uligevægt mellem de steder, vi undersøgte, og det eller de funktionelle steder.

begge alleler af hele Mc1r-genet (954 bp) blev sekventeret i de 69 mus i Fig. 1. Fireogtyve enkeltnukleotidpolymorfier blev observeret: 15 var synonyme og 9 var ikke-synonymt. Fire af de ni aminosyrepolymorfier blev kun observeret i de mørke mus fra Pinacat-lokaliteten (Arg-18-Kurt Cys, Arg-109-Kurt Trp, Arg-160-Kurt Trp og Gln-233-Kurt His). Disse fire aminosyrevarianter var til stede ved høj frekvens (82%) blandt de Pinacate mørke mus og var i fuldstændig sammenkædning uligevægt med hinanden. Alle andre Mc1r-aminosyrepolymorfier var til stede ved lave frekvenser og viste ingen tilknytning til musefarve. Fordelingen af Mc1r-nukleotidvariation blandt lette og melaniske mus fra Pinacatstedet er vist i tabel 1.

flere observationer antyder, at en eller flere af disse fire aminosyremutationer (sted 18, 109, 160 og 233) er ansvarlige for de lys/mørke fænotypiske forskelle, der ses i Pinacatpopulationen. For det første er der en perfekt sammenhæng mellem genotype og fænotype (tabel 2). I en enkelt panmiktisk population uden assortativ parring er en sammenhæng mellem genotypisk og fænotypisk variation uventet, medmindre genet eller et tæt forbundet gen er ansvarlig for fænotypen. Imidlertid kan populationsstruktur producere en falsk forening, selv når et gen ikke er involveret i de fænotypiske forskelle (19). Vi testede denne hypotese ved at sekvensere mitokondrie COIII og ND3 gener i alle mus fra Pinacate lokaliteten (n = 29). En fylogeni af disse mitokondrielle gener viser, at haplotyper fra lyse og mørke mus blandes, hvilket ikke giver noget bevis for skjult befolkningsstruktur (Fig. 2). Fordi mest genstrømning i Chaetodipus sandsynligvis medieres af mænd (20), og fordi mitokondriegenomet har en effektiv populationsstørrelse en fjerdedel af den effektive størrelse af autosomer, giver mitokondrielt DNA en følsom markør til påvisning af populationsstruktur. Disse mtDNA-data giver også yderligere bevis for selektion på de mørke/lette fænotypiske forskelle. I Pinacatpopulationen kan hyppigheden af mørke mus på let substrat (9%) og hyppigheden af mørke mus på mørkt substrat (89%) bruges til at estimere graden af befolkningsdifferentiering for fænotypiske forskelle mellem disse to tilstødende områder . Denne værdi er > 10 gange større end den tilsvarende værdi for mtDNA , i overensstemmelse med ideen om, at valg driver de fænotypiske forskelle. Fremtidige undersøgelser baseret på større prøver ved hjælp af denne tilgang vil gøre det muligt for os at estimere størrelsen af udvælgelsen fra modeller for migrationsudvælgelsesbalance.

for det andet forårsager alle fire ikke-synonyme substitutioner, der viser en tilknytning til pelsfarve, en ændring i aminosyreladning. På de første tre aminosyresteder (18, 109, 160) er ændringen fra et positivt ladet arginin til en uladet aminosyre. På det fjerde sted (233) erstattes en uladet glutamin med et positivt ladet histidin. Derudover er alle fire mutationer placeret i funktionelt vigtige regioner i receptoren, der sandsynligvis vil være involveret i interaktioner med andre proteiner. To af substitutionerne er placeret i ekstracellulære regioner (aminosyrested 18 og 109), og to er placeret i intracellulære regioner (sted 160 og 233); ingen er placeret i transmembrane domæner af receptoren (Fig. 3). Et antal tidligere beskrevne mørke fænotyper ved forlængelsesstedet i musen (16) og andre organismer (21-25) skyldes enkelte aminosyremutationer i MC1R, skønt ingen af de mutationer, der er beskrevet her, tidligere er rapporteret. I laboratoriemusen er tobakken (etob) og de dystre (Eso) mørkere alleler forårsaget af mutationer i henholdsvis de første intracellulære og første ekstracellulære domæner. Etob koder for en melanocortin-1-receptor, der forbliver lydhør over for det kur-melanocytstimulerende hormon, men som er hyperaktivt, hvorimod Eso koder for en konstitutivt aktiv receptor (16). Ligesom etob-allelen i Mus har melanic C. intermedius rapporteret her mørk farve begrænset til dorsum.

for det tredje er den mørke allel dominerende over den lyse allel, i overensstemmelse med observationer af Mc1r-mutationer i musen (11, 16) og andre organismer (21-25). I laboratoriemusen er tab af funktionsmutationer ved Mc1r recessive og resulterer i lys farve, mens forstærkning af funktion alleler er dominerende og resulterer i mørk farve (16). Alle heterosygøse mus observeret på Pinacatstedet er mørke med ubåndede hår og ligner fænotypisk de homosygøse mørke mus.

endelig antyder mønsteret af nukleotidvariation observeret blandt Mc1r-alleler fra Pinacatstedet den nylige virkning af positiv selektion. Tretten polymorfe steder er variable blandt de lyse haplotyper, mens kun et sted er variabelt blandt de mørke haplotyper (tabel 1). Forholdet mellem variant og invariante steder er signifikant forskelligt mellem mørke og lyse alleler (1/953 og 13/941, Fishers nøjagtige test, P < 0,01). Det gennemsnitlige niveau af nukleotiddiversitet blandt lette alleler (LARP = 0.21%) er > 10 gange større end nukleotiddiversiteten blandt mørke alleler (kur = 0,01%). Den reducerede variabilitet set blandt de mørke Mc1r-alleler er det forventede mønster, hvis udvælgelsen for nylig har rettet en adaptiv substitution (26-28). Et enkelt lydløst sted (nukleotid 633) er i fuldstændig sammenknytningsuligevægt med aminosyresubstitutionerne til stede i alle Mørke Dyr; dette mønster er i overensstemmelse med genetisk hitchhiking af dette tavse sted på den valgte haplotype. To standardtests af neutralitet (29, 30) registrerer imidlertid ikke udvælgelse på Mc1r i Pinacatpopulationen, enten i den samlede prøve eller i underpopulationerne på lys eller mørkt substrat. McDonald-Kreitman-testen (29) sammenligner forholdet mellem synonyme og ikke-synonyme ændringer inden for og mellem arter; her ændres dette forhold kun lidt af de fire aminosyresubstitutioner, der adskiller de lyse og mørke Mc1r-alleler. HKA-testen (30) sammenligner variation inden for og mellem arter for to forskellige gener (i dette tilfælde Mc1r og mtDNA); niveauet af nukleotidvariabilitet ved Mc1r reduceres imidlertid ikke signifikant, selv i underpopulationen på mørkt substrat på grund af tilstedeværelsen af Mc1r-heterosygoter.

på grund af fuldstændig uligevægt mellem aminosyresteder 18, 109, 160 og 233 (tabel 1) tillader vores data os ikke at bestemme de relative bidrag fra hvert af disse steder til de observerede forskelle i farve, og de udelukker heller ikke muligheden for, at et bundet gen er ansvarlig for observerede fænotypiske forskelle. Sidstnævnte mulighed synes usandsynlig af de ovenfor beskrevne grunde og også fordi ingen kandidatpigmenteringsgener er tæt knyttet til Mc1r hos hverken mennesker eller Mus. I laboratoriemusen er enkelt aminosyreændringer ved Mc1r tilstrækkelige til at producere en mørk farve (16). Funktionelle undersøgelser, der bruger Mc1r-konstruktioner i et in vitro-ekspressionssystem, kan bruges til at måle den relative effekt af de fire mutationer på aktiveringen af receptoren. Foreløbige resultater fra cAMP-analyser indikerer, at den mørke allel koder for en hyperaktiv receptor i forhold til lysallelen, hvilket giver stærk støtte til Mc1r ‘ s rolle i de observerede fænotypiske forskelle (H. E. H., H. Fujino, J. Regan og M. V. N., upublicerede data). Brug af denne tilgang med konstruktioner, der indeholder hver af de fire mutationer individuelt og i kombination, vi håber at skelne mellem to forskellige modeller til Mc1r evolution: (i) en enkelt aminosyreforskel er ansvarlig for de observerede fænotypiske forskelle, og de andre aminosyrevarianter har hitchhiked med det valgte sted, eller (ii) to eller flere aminosyrevarianter (der virker additivt eller epistisk) er nødvendige for at producere de observerede fænotypiske forskelle.

påfaldende implicerer de data, der præsenteres her, aminosyreændringer ved Mc1r i den mørke fænotype i Pinacatpopulationen, men ikke i Armendaris-populationen. Der blev kun observeret en Mc1r-aminosyrepolymorfisme (Ala-285 liter Thr) blandt de 40 alleler fra Armendaris; denne variant var til stede i 2 af 24 alleler i lette mus og 0 af 16 alleler i mørke mus. To tavse polymorfier var til stede ved mellemfrekvenser (48%) blandt de 40 Armendaris-alleler, men ingen af dem viste nogen tilknytning til musefarve. Faktisk var frekvenserne af disse polymorfier meget ens blandt mørke (50%) og lette (45%) mus. Fraværet af en sammenhæng mellem nukleotidpolymorfier i Mc1r-kodningsregionen og musefarve ved Armendaris gør det også usandsynligt, at usurveyerede steder i promotorregionen er ansvarlige for de fænotypiske forskelle, medmindre koblingsuligevægt henfalder ekstremt hurtigt. Promotorregionen Mc1r har været godt karakteriseret i både mus (31) og mennesker (32), og den ligger 500 BP opstrøms for startkodonet. Generelt mønstre af nukleotidvariation i det kodende område af Mc1r i prøverne fra Armendaris (både lys og mørk), Portal og Avra Valley var usædvanlige. Niveauer af nukleotiddiversitet varierede fra 0,11% til 0,19%, svarende til værdien set for de lette dyr fra Pinacatstedet.

det faktum, at de fire mutationer, der ses i melanic Pinacate-musene (Arg-18 Kristian Cys, Arg-109 Kristian Trp, Arg-160 Kristian Trp og Gln-233 Kristian his), er fraværende i melanic-musene fra Armendaris, indikerer, at en lignende mørk fænotype har udviklet sig uafhængigt af disse forskellige lavastrømme og har gjort det gennem forskellige genetiske ændringer, selvom genet / generne involveret i Armendaris-populationen endnu ikke er identificeret. Det forskellige molekylære grundlag for den samme fænotype i to forskellige populationer giver stærke beviser for konvergent fænotypisk udvikling på en relativt kort tidsskala; begge lavastrømme er mindre end en million år gamle.

mens Mc1r-mørkningsmutationer er blevet identificeret i andre arter (16, 21-25), forstås den økologiske kontekst for ændringerne enten ikke (24, 25) eller skyldes kunstig selektion (22, 23). Ugler er vigtige rovdyr for lommemus (8, 9) og er kendt for at skelne mellem lyse og mørke mus på lyse og mørke underlag, selv når de foder om natten under lav lysintensitet (10). Det er således sandsynligt, at ugler spiller en vigtig rolle i udvælgelsen til at skjule farve. De her rapporterede data præsenterer et sjældent eksempel på de molekylære ændringer, der ligger til grund for tilpasning i en enkel og naturlig økologisk indstilling.