Identifikation af funktionelle markørproteiner i pattedyrs vækstkegle

verifikation af lokalisering af Vækstkegle antyder en ubetydelig falsk-positiv hastighed.

vi ønskede derefter at bestemme specificiteten af vores proteomiske tilgang; dvs.at bestemme den falsk-positive sats. Generelt bør en sammenligning af en given fraktion foretages med en anden biokemisk fraktion. Imidlertid kan ingen fraktioner fra den udviklende hjerne fremstilles med sammenlignelig renhed til GCP-eller GCM-fraktionerne. For at lette genereringen af et sammenligningsdatasæt udførte vi således systematisk immunodetektion af en delmængde af proteinerne i dyrkede kortikale neuroner (se tabel S4, tabel S5, tabel S6 og tabel S7). Vi udelukkede allestedsnærværende eller almindeligt udtrykte proteiner, såsom metaboliske og molekylære chaperoner, så vi i stedet kunne fokusere på proteiner, der kan være særligt relevante for vækstkeglespecifikke funktioner. I alt så vi på fordelingen af 131 proteiner (dvs.15% af de proteiner, vi identificerede). Dataene bekræfter, at i dyrkede rotte kortikale neuroner er alle de proteiner, vi testede, detekterbare i vækstkegleområdet (Fig. 2 og tabel S4). Faktisk kunne ingen proteiner, vi testede, påvises i andre aksonale regioner, men ikke i vækstkeglen, hvilket tyder på en meget lav falsk positiv hastighed og validerer vores overordnede tilgang. Derudover indeholdt vores proteomiske data i GCP eller GCM ingen transkriptionsfaktorer, hvilket antyder, at forurening med nukleare komponenter også er ubetydelig (Fig. 1D, tabel S1 og tabel S2).

proteiner mere koncentreret i vækstkeglen end i den distale Akson.

vi forsøgte derefter at bestemme, i hvilket omfang proteinerne identificeret i vores undersøgelse er specifikke eller lokalt specifikke for vækstkeglen. For at gøre dette sammenlignede vi fordelingen af proteinerne i vækstkegler med deres fordeling i distale aksoner. I det omfang metoden er kvantitativ, var vi også i stand til at sammenligne de relative koncentrationer af proteiner i vækstkegler versus distale aksoner (Fig. 2 og tabel S4). Vi definerede vækstkegleakkumuleringsindekset som forholdet mellem fluorescensintensitet (FI) i vækstkeglen sammenlignet med det i den distale akson (Fig. 2, Tabel S4, si-tekst og Fig. S1). Vi brugte også et andet indeks, dvs.arealforholdet, til at undersøge fordelingsmønstrene for hvert protein (Fig. S2). Vækstkegleakkumuleringsindekset er en indikation af det relative niveau af proteinakkumulering i vækstkeglen. Ved at anvende den statistiske rang-sum-test på vores resultater, lette streng klassificering af de undersøgte proteiner sammenlignet med GAP-43, vores kvantificering af den systematiske immunfarvende tilgang ved hjælp af dette indeks afslørede, at så mange som 69 proteiner identificeret af proteomics blev påvist ved højere niveauer i vækstkegleområdet end i den distale akson. Disse proteiner ser ud til at være på meget højere niveauer i vækstkegler end den aktuelt etablerede vækstkeglemarkørproteingab-43 (7) (Fig. 2, vist i rødt). Vi fandt også, at for 33 proteiner overlapper de statistiske fejlområder med GAP-43, således kategoriserer vi dette sæt proteiner som koncentreret i vækstkeglen i samme grad som GAP-43 (Fig. 2, vist i blåt).

RNAi-analyse afslører relevans for Aksonlængde og funktionelle markører for vækstkeglen.

vi brugte en RNAi-baseret tilgang til at teste markørproteinkandidaternes roller i aksonal vækst. Aktivitetsinducerende aksonal vækst blev vurderet ved måling af aksonal Længde (se SI-tekst; til bekræftelse af nedslag og specificitet, se også Fig. S1). Vi valgte 68 gener til RNAi-behandling og fandt, at forstyrrelse af 17 af dem førte til kortere aksonal længde ved anvendelse af en streng ikke-parametrisk test, dvs.Kruskal-Vilis-testen (Fig. 3a, tabel 1 og tabel S8). Vi kategoriserer de 17 proteiner som formodede funktionelle vækstkeglemarkører (tabel 1). I betragtning af resultaterne af den kvantitative immunfarvning (Fig. 2), kan disse proteiner klassificeres i proteiner, der er mere koncentreret end GAP-43 (proteiner vist i rødt i Fig. 2) eller ligner GAP-43 (proteiner vist i blåt i Fig. 2). Af disse 17 proteiner er der fem cytoskeletale proteiner (Tmod2, Cap1, Cotl1 og 2.September), fire membranproteiner (Pacs1, Stks7, Snap25a og Rtn1), to GTP-bindende proteiner (Gnai2, Gnao1), to proteiner involveret i lille g-proteinsignalering (Farp2 og Cyfip1), tre signaladapterproteiner (rem, FABP7 og Crmp1) og en receptor kandidat (Clptm1).

de fleste af de kandidater, der er anført i Fig. 3A afslørede tidligere uopdagede foreninger med vækstkegler og var funktionelt relaterede (tabel 1). Sept2, Cap1 (et G-actinbindende protein), Snap25a og Cyfip1 er blevet foreslået at spille roller i vækstkegleadfærd, baseret på undersøgelser i PC12-celler eller chick-eller Drosophila-neuroner (21-24), Men deres nøjagtige roller i pattedyrs vækstkegle er ikke kendt. For de to GTP-bindende proteiner (Gnai2, Gnao1) og regulatoren (Farp2) er involvering i regulering af en vækstkeglerespons på hæmmere rapporteret, skønt det ikke vides, om de er nødvendige eller uundværlige for aksonal vækst (25-27). Så vidt vi ved, ingen af de andre 10 proteiner blev tidligere rapporteret at være vækstkegleregulatorer i pattedyrceller eller hvirvelløse modelorganismer såsom C. elegans eller Drosophila, skønt deres paraloger kan være relateret til neuritvækst . Vi opsummerer kort de aktuelle oplysninger om disse proteiner i tabel 1. Højst 3 af de 17 proteiner, der er identificeret i vores undersøgelse og testet med RNAi, har tidligere været impliceret i aksonal vækst, hvilket tyder på, at vi lykkedes effektiv identifikation af yderligere molekyler involveret i vækstkeglefunktioner. I alt peger resultaterne af RNAi-analyse på 17 proteiner med højere eller lignende FI-forhold end GAP-43, hvilket gør dem til stærke kandidater til nye neuronale vækstassocierede proteiner (nGAPs; refs. 4 og 30).

vækstkeglen består af morfologisk og funktionelt adskilte regioner kaldet de centrale (C) og perifere (P) regioner (31). C-regionen er beriget med vesikler og mikrotubuli og er sandsynligvis involveret i membranudvidelse for aksonal vækst. P-regionen er beriget med actinfilamenter og genererer sandsynligvis drivkraft. Brug af tubulin som markør for C-regionen (se Fig. S3) klassificerede vi markørproteinerne i fire grupper: gruppe i, lokaliseret overvejende i P-regionen; gruppe II, detekteret i begge regioner; Gruppe III, lokaliseret overvejende i C-regionen; og gruppe IV, specifikt lokaliseret i C-regionen (Fig. 3B; se også fig. S3 og S4).

de lokaliseringsmønstre, vi observerede, var noget anderledes end hvad der kunne have været forudsagt. For eksempel er Pacs1 rapporteret at være involveret i organelsortering, men i aksoner lokaliseres Pacs1 til P-regionen, hvor F-actin er beriget (Fig. 3B). Et formodet opløseligt adapterprotein, Strap, der er rapporteret som nedstrøms for TGF-kur-signalering (32), og Clptm1, et ukendt transmembranprotein (33), er også lokaliseret i p-regionen. I modsætning hertil detekteres 2. September nær det tubulin-positive område på trods af, at det tidligere blev rapporteret at være fundet i P-domænet i PC12-celler (21). Kun Rtn1, en er-protein-og formodet membranhandelsregulator (34), var specifikt lokaliseret i C-regionen, hvilket gjorde det potentielt nyttigt som en C-regionsmarkør.