Identifikasjon av funksjonelle markørproteiner i pattedyrsvekstkeglen

Verifisering Av Vekstkegle Lokalisering Antyder En Ubetydelig Falsk Positiv Rate.

vi neste ønsket å bestemme spesifisiteten av vår proteomikk tilnærming,; dvs. å bestemme falsk-positiv rate. Generelt bør en sammenligning av en gitt fraksjon gjøres til en annen biokjemisk fraksjon. Imidlertid kan ingen fraksjoner fra den utviklende hjernen fremstilles med sammenlignbar renhet TIL gcp-eller GCM-fraksjonene. For å lette generering av et sammenligningssett utførte vi systematisk immunodeteksjon av en delmengde av proteinene i dyrkede kortikale nevroner (Se Tabell S4, Tabell S5, Tabell S6 og Tabell S7). Vi ekskluderte allestedsnærværende eller vanlig uttrykte proteiner som metabolske enzymer og molekylære chaperoner, slik at vi i stedet kunne fokusere på proteiner som kan være spesielt relevante for vekstkeglespesifikke funksjoner. Totalt sett så vi på fordelingene av 131 proteiner (dvs. ≈15% av proteinene vi identifiserte). Dataene bekrefter at i kultiverte rotte kortikale nevroner er alle proteinene vi testet detekterbare i vekstkegleområdet(Fig . 2 Og Tabell S4). Faktisk kunne ingen proteiner vi testet detekteres i andre aksonale regioner, men ikke i vekstkeglen, noe som tyder på en svært lav falsk positiv hastighet og validering av vår overordnede tilnærming. I tillegg inneholdt våre proteomiske data I GCP eller GCM ingen transkripsjonsfaktorer, noe som tyder på at forurensning med kjernekomponenter også er ubetydelig (Fig. 1D, Tabell S1 Og Tabell S2).

Proteiner Mer Konsentrert I Vekstkeglen Enn I Distal Axon.

vi søkte deretter å bestemme i hvilken grad proteinene identifisert i vår studie er spesifikke eller lokalt spesifikke for vekstkeglen. For å gjøre dette, sammenlignet vi fordelingene av proteinene i vekstkegler med deres fordeling i distale axoner. I den grad metoden er kvantitativ, kunne vi også sammenligne de relative konsentrasjonene av proteiner i vekstkegler versus distale aksoner(Fig . 2 Og Tabell S4). Vi definerte vekstkjegleakkumuleringsindeksen som forholdet mellom fluorescensintensitet (FI) i vekstkjeglen sammenlignet med det i distalaksonen (Fig. 2, Tabell S4, Si Tekst Og Fig. S1). Vi brukte også en annen indeks, dvs. arealforholdet, for å undersøke distribusjonsmønstrene til hvert protein(Fig. S2). Vekstkegleakkumuleringsindeksen er en indikasjon på det relative nivået av proteinakkumulering i vekstkeglen. Ved å bruke den statistiske Wilcoxon rank-sum-testen til våre resultater, lette streng klassifisering av de undersøkte proteinene sammenlignet med GAP-43, viste vår kvantifisering av den systematiske immunostholdende tilnærmingen ved hjelp av denne indeksen at så mange som 69 proteiner identifisert av proteomikk ble detektert på høyere nivåer i vekstkegleområdet enn i distal axon. Disse proteinene ser ut til å være på mye høyere nivåer i vekstkegler enn den for tiden etablerte vekstkeglemarkørproteingapet-43 (7) (Fig. 2, vist i rødt). Vi fant også at for 33 proteiner overlapper de statistiske feilområdene MED GAP-43, og dermed kategoriserer vi dette settet av proteiner som konsentrert i vekstkeglen i samme grad SOM GAP-43(Fig . 2, vist i blått).

Rnai Analyse Viser Relevans For Axon Lengde og Funksjonelle Markører Av Vekst Kjegle.

Vi brukte En RNAi – basert tilnærming for å teste rollene til markørproteinkandidater i aksonal vekst. Aktivitetsinduserende aksonal vekst ble vurdert ved å måle aksonal lengde (Se SI Tekst; for bekreftelse av knockdown og spesifisitet, Se Også Fig. S1). Vi valgte 68 gener For RNAi-behandling og fant at forstyrrelse av 17 av dem førte til kortere aksonal lengde, ved bruk av en streng ikke-parametrisk test, dvs. Kruskal-Willis-testen (Fig. 3A, Tabell 1 Og Tabell S8). Vi kategoriserer de 17 proteinene som antatte functional growth cone markers (Tabell 1). Tatt i betraktning resultatene av den kvantitative immunostholdende (Fig. 2), disse proteinene kan klassifiseres i proteiner mer konsentrert ENN GAP-43 (proteiner vist i rødt I Fig. 2) eller lik GAP-43 (proteiner vist i blått I Fig. 2). Av disse 17 proteiner, er det fem cytoskeletal proteiner (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb, Og September 2), fire membran trafficking proteiner (Pacs1, Stx7, Snap25a, Og Rtn1), to GTP-bindende proteiner (Gnai2, Gnao1), to proteiner involvert i små g protein signalering (Farp2 Og Cyfip1), tre signal adapter proteiner (Stropp, FABP7, Og Crmp1), og en reseptor kandidat (Clptm1).

De fleste av kandidatene oppført I Fig. 3A avslørte tidligere uoppdagede foreninger med vekstkegler og var funksjonelt relaterte (Tabell 1). Sept2, Cap1 (Et g-actinbindende protein), Snap25a og Cyfip1 har blitt foreslått å spille roller i vekstkegleadferd, basert på studier I PC12-celler eller chick-eller Drosophila-nevroner (21-24), men deres presise roller i pattedyrets vekstkegle er ikke kjent. For de TO gtp-bindende proteinene (Gnai2, Gnao1) og regulatoren (Farp2) er det rapportert om involvering i regulering av en vekstkonusrespons på hemmere, selv om det ikke er kjent om de er nødvendige eller uunnværlige for aksonal vekst (25-27). Så vidt vi vet, ingen av de andre 10 proteiner ble tidligere rapportert å være vekst kjegle regulatorer i pattedyrceller eller virvelløse modellorganismer Som C. elegans eller Drosophila, selv om deres paraloger kan være relatert til neuritt vekst . Vi oppsummerer kort den nåværende informasjonen om disse proteinene I Tabell 1. På det meste 3 av 17 proteiner identifisert i vår studie og testet Med RNAi har tidligere vært involvert i aksonal vekst, noe som tyder på at vi lyktes i effektiv identifisering av flere molekyler involvert i vekst kjegle funksjoner. Totalt peker resultatene Av rnai-analysen på 17 proteiner med høyere ELLER lignende FI-forhold enn GAP-43, noe som gjør dem sterke kandidater for nye nevronvekstassosierte proteiner (nGAPs; refs. 4 og 30).

vekstkjeglen består av morfologisk og funksjonelt distinkte regioner referert til som de sentrale (C) og perifere (P) regionene (31). C-regionen er beriket i vesikler og mikrotubuli og er sannsynligvis involvert i membranutvidelse for aksonal vekst. P-regionen er beriket i aktinfilamenter og genererer sannsynligvis motivkraft. Bruk av tubulin som markør For c-regionen (Se Fig. S3), klassifiserte vi markørproteinene i fire grupper: gruppe I, lokalisert hovedsakelig I p-regionen; gruppe II, oppdaget i begge regioner; GRUPPE III, lokalisert overveiende I C-regionen; og gruppe IV, spesielt lokalisert I C-regionen(Fig. 3B; se Også Fig. S3 og S4).

lokaliseringsmønstrene vi observerte var noe annerledes enn det som kunne ha vært spådd. For Eksempel Har Pacs1 blitt rapportert å være involvert i organell sortering, men i axoner lokaliserer Pacs1 Til p-regionen, hvor F-actin er beriket (Fig. 3B). Et antatt oppløselig adapterprotein, Stropp, som er rapportert som nedstrøms FOR TGF-β signalering (32), Og Clptm1, et ukjent transmembranprotein (33), er også lokalisert I p-regionen. I motsetning til Dette oppdages 2. September nær den tubulin-positive regionen til tross for at Det tidligere ble rapportert å bli funnet I p-domenet I PC12-celler (21). Bare Rtn1, en er-protein og antatt membranhandel regulator (34), var spesielt lokalisert I C-regionen, noe som gjør den potensielt nyttig som En c-region markør.