- Ergebnisse
- Groß Angelegte Identifizierung von Proteinen in Rattengehirnwachstumskegeln.
- Die Verifizierung der Lokalisierung von Wachstumskegeln deutet auf eine vernachlässigbare falsch-positive Rate hin.
- Proteine konzentrierter im Wachstumskegel als im distalen Axon.
- RNAi-Analyse zeigt Relevanz für Axonlänge und funktionelle Marker des Wachstumskegels.
Ergebnisse
Groß Angelegte Identifizierung von Proteinen in Rattengehirnwachstumskegeln.
Unser erstes Ziel war es, eine große Anzahl von Proteinen zu identifizieren, die in Wachstumskegeln exprimiert werden, einschließlich Proteinen, die vielen Zelltypen gemeinsam sind, und Proteinen, die an wachstumskegelspezifischen Funktionen beteiligt sind. Dazu trennten wir zunächst Proteine aus dem sich entwickelnden Rattenvorhirn durch subzelluläre Fraktionierung, um eine GCP-Fraktion zu erhalten (Abb. 1A). Wir erhielten dann ein GCM über hypotonische Behandlung der GCP-Fraktion (siehe Details im Text) mit dem Ziel, kleinere Membranproteine im Wachstumskegel zu identifizieren. Anschließend verwendeten wir multidimensionale Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC / MS / MS), um einzigartige Proteine in der Probe zu identifizieren, da sich die Methode als geeignet für die groß angelegte Proteinidentifikation erwiesen hat (15, 16). Die Methode erwies sich auch in dieser Studie als leistungsstark, wobei insgesamt 945 Proteinspezies in GCP und GCM identifiziert wurden (Abb. 1B). Da bisher bekannt war, dass < 50 der Proteine im Wachstumskegel von Säugetieren exprimiert wurden, liefert die Identifizierung dieser großen Anzahl von Proteinen eine Fülle molekularer Informationen über Wachstumskegel von Säugetieren (2, 4, 17). Zum Vergleich analysierten wir auch adulte Synaptosomen, das Gegenstück zum Wachstumskegel, und identifizierten 1.407 Arten synaptosomaler Proteine (dh doppelt so viele wie für GCP und GCM). Ungefähr 65% der von uns identifizierten synaptosomalen Proteine finden sich nicht in den GCP- oder GCM-Sets (Abb. 1C), was darauf zurückzuführen sein kann, dass nach der Synaptogenese eine große Anzahl von Proteinen neu synthetisiert und zu synaptischen Komponenten für die synaptische Übertragung hinzugefügt wird. Es gelang uns, 96 und 141 Proteine im GCP bzw. GCM zu identifizieren, die nicht in den Synaptosomen gefunden wurden (Abb. 1C).
Die Verifizierung der Lokalisierung von Wachstumskegeln deutet auf eine vernachlässigbare falsch-positive Rate hin.
Als nächstes wollten wir die Spezifität unseres Proteomik-Ansatzes bestimmen, d. H. Die falsch-positive Rate bestimmen. Im Allgemeinen sollte ein Vergleich einer gegebenen Fraktion mit einer anderen biochemischen Fraktion durchgeführt werden. Es können jedoch keine Fraktionen aus dem sich entwickelnden Gehirn mit vergleichbarer Reinheit wie die GCP- oder GCM-Fraktionen hergestellt werden. Um die Erstellung eines Vergleichsdatensatzes zu erleichtern, führten wir daher eine systematische Immundetektion einer Teilmenge der Proteine in kultivierten kortikalen Neuronen durch (siehe Tabelle S4, Tabelle S5, Tabelle S6 und Tabelle S7). Wir haben ubiquitäre oder häufig exprimierte Proteine wie Stoffwechselenzyme und molekulare Chaperone ausgeschlossen, um uns stattdessen auf Proteine zu konzentrieren, die für wachstumskegelspezifische Funktionen besonders relevant sein können. Insgesamt untersuchten wir die Verteilungen von 131 Proteinen (dh ≈15% der von uns identifizierten Proteine). Die Daten bestätigen, dass in kultivierten kortikalen Neuronen der Ratte alle von uns getesteten Proteine im Wachstumskegelbereich nachweisbar sind (Abb. 2 und Tabelle S4). Tatsächlich konnten keine von uns getesteten Proteine in anderen axonalen Regionen nachgewiesen werden, jedoch nicht im Wachstumskegel, was auf eine sehr niedrige falsch-positive Rate hindeutet und unseren Gesamtansatz validiert. Darüber hinaus enthielten unsere proteomischen Daten in GCP oder GCM keine Transkriptionsfaktoren, was darauf hindeutet, dass die Kontamination mit nuklearen Komponenten ebenfalls vernachlässigbar ist (Abb. 1D, Tabelle S1 und Tabelle S2).
Abb. 2.
Immunfluoreszenz-Quantifizierung von GCP. Horizontale Achse, Flächenverhältnis (Wachstumskegel / distales Axon), Längsachse, Flächenverhältnis (Wachstumskegel / distales Axon). Die horizontale Achse zeigt den GC-Akkumulationsindex (ein Verhältnis von 1,0; die vertikale schwarz gepunktete Linie zeigt an, dass ein gegebenes Protein gleichmäßig im distalen Axon gegenüber dem Wachstumskegel verteilt ist). Das FI-Verhältnis für GAP-43 (Gap43; 1,315) ist als blaue gepunktete Linie dargestellt. Proteine im oberen rechten Bereich des Diagramms sind im Wachstumskegel konzentrierter als im Axon. Viele davon sind aktinbindende Proteine und Proteine, die am vesikulären Handel beteiligt sind. Das FI-Verhältnis jedes Proteins wurde unter Verwendung des statistischen Kruskal-Willis-Tests (46) mit GAP-43 als Vergleichspunkt getestet. Die Proteine wurden basierend auf dem zweiseitigen 95% -Konfidenzintervall gruppiert, d. H. War es höher als, ähnlich oder kleiner als das von GAP-43 (jeweils in rot, blau und schwarz dargestellt). Beachten Sie, dass erwartungsgemäß F-Aktin (wie mit Rhodaminphalloidin nachgewiesen; in rot), das im Wachstumskegel konzentriert ist, und β-Tubulin (grün), das im Axon höher ist als im Wachstumskegel, in der Grafik voneinander entfernt sind. Siehe Tabelle S4 für detaillierte Informationen.
Proteine konzentrierter im Wachstumskegel als im distalen Axon.
Als nächstes wollten wir bestimmen, inwieweit die in unserer Studie identifizierten Proteine spezifisch oder lokal spezifisch für den Wachstumskegel sind. Dazu verglichen wir die Verteilung der Proteine in Wachstumskegeln mit ihrer Verteilung in distalen Axonen. Soweit die Methode quantitativ ist, konnten wir auch die relativen Konzentrationen von Proteinen in Wachstumskegeln mit distalen Axonen vergleichen (Abb. 2 und Tabelle S4). Wir definierten den Wachstumskegelakkumulationsindex als das Verhältnis der Fluoreszenzintensität (FI) im Wachstumskegel im Vergleich zu der im distalen Axon (Abb. 2, Tabelle S4, SI-Text und Fig. S1). Wir verwendeten auch einen anderen Index, d. H. das Flächenverhältnis, um die Verteilungsmuster jedes Proteins zu untersuchen (Abb. S2). Der Wachstumskegelakkumulationsindex ist ein Hinweis auf den relativen Grad der Proteinakkumulation im Wachstumskegel. Durch die Anwendung des statistischen Wilcoxon Rank-Sum-Tests auf unsere Ergebnisse, Erleichterung der strengen Klassifizierung der untersuchten Proteine im Vergleich zu GAP-43, Unsere Quantifizierung des systematischen Immunfärbungsansatzes unter Verwendung dieses Index ergab, dass nicht weniger als 69 Durch Proteomik identifizierte Proteine wurden in höheren Konzentrationen im Wachstumskegelbereich als im distalen Axon nachgewiesen. Diese Proteine scheinen in Wachstumskegeln viel höher zu sein als das derzeit etablierte Wachstumskegelmarkerprotein GAP-43 (7) (Abb. 2, rot dargestellt). Wir fanden auch heraus, dass für 33 Proteine die statistischen Fehlerbereiche mit denen von GAP-43 überlappen, daher kategorisieren wir diesen Satz von Proteinen als konzentriert im Wachstumskegel in ähnlichem Maße wie GAP-43 (Abb. 2, blau dargestellt).
RNAi-Analyse zeigt Relevanz für Axonlänge und funktionelle Marker des Wachstumskegels.
Wir haben einen RNAi-basierten Ansatz verwendet, um die Rolle von Markerproteinkandidaten beim axonalen Wachstum zu testen. Das aktivitätsinduzierende axonale Wachstum wurde durch Messung der axonalen Länge beurteilt (siehe SI-Text; zur Bestätigung des Knockdowns und der Spezifität siehe auch Abb. S1). Wir wählten 68 Gene für die RNAi-Behandlung aus und fanden heraus, dass die Störung von 17 von ihnen durch Anwendung eines strengen nichtparametrischen Tests, d. H. Des Kruskal-Willis-Tests, zu einer kürzeren axonalen Länge führte (Abb. 3A, Tabelle 1 und Tabelle S8). Wir kategorisieren die 17 Proteine als mutmaßliche funktionelle Wachstumskegelmarker (Tabelle 1). Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der quantitativen Immunfärbung (Abb. 2) können diese Proteine in Proteine eingeteilt werden, die konzentrierter sind als GAP-43 (Proteine, die in Abb. 2) oder ähnlich GAP-43 (in Fig. 2). Von diesen 17 Proteinen gibt es fünf Zytoskelettproteine (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb und Sept 2), vier Membrantransportproteine (Pacs1, Stx7, Snap25a und Rtn1), zwei GTP-bindende Proteine (Gnai2, Gnao1), zwei Proteine, die an der Signalisierung kleiner G-Proteine beteiligt sind (Farp2 und Cyfip1), drei Signaladapterproteine (Strap, FABP7 und Crmp1) und ein Rezeptorkandidat (Clptm1).
Abb. 3.
Identifizierung von nGAPs durch RNAi. (A) Gene, die das axonale Wachstum beeinflussen. Die Rolle der identifizierten Proteine in der Wachstumskegelaktivität wurde durch die Suche nach einer RNAi-induzierten Reduktion des axonalen Wachstums untersucht. RNAi wurde wie beschrieben durchgeführt (45). Die acht Proteine links von der schraffierten Linie haben FI-Verhältnisse, die GAP-43 überlegen sind, wie statistisch unter Verwendung des Kruskal-Willis-Tests beurteilt (rot; auch in Abb. 2), und die neun Proteine rechts von der schraffierten Linie haben FI-Verhältnisse ähnlich denen von GAP-43, wie durch denselben Test beurteilt. Als Kontrolle wurden die axonalen Längen von EGFP-positiven Neuronen (keine siRNA) verwendet (blau; in Fig. 2). Alle siRNAs (außer GFP) haben P < 0,002 im Wilcoxon Rank-Sum-Test (vs. Kontrolle) (46). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Die Anzahl der gemessenen Neuronen wird am unteren Rand jedes Balkens angezeigt. (B) Klassifizierung von Kandidatenwachstumskegelmarkerproteinen durch Immunlokalisation. Wir definierten die C- und P-Domänen eines Wachstumskegels durch quantitative Analyse von Immunfärbungsbildern (Diagramm oben; siehe SI-Text und Abb. S2). Wir haben die Proteine in vier Gruppen eingeteilt: Gruppe I (Ex. Pacs1), vorwiegend lokalisiert in der P-Region (CP); Gruppe II (Bsp. Syx7), nachgewiesen sowohl in der C- als auch in der P-Region (C ≃ P); Gruppe III (Bsp. Gnai2), vorwiegend lokalisiert in der C-Region (C ≫ P); und Gruppe IV (Bsp. Rtn1), spezifisch lokalisiert in der C-Region (C). In jedem Fall ist das linke Diagramm eine Zusammenfassung einer typischen Proteinverteilung für jede Gruppe. Immunfluoreszenz-Mikroaufnahmen des Antikandidat-Protein-Antikörpernachweises in kultivierten kortikalen Rattenneuronen sind in A. Magenta und Grün zeigen Antigenprotein- bzw. α-Tubulin-Ansichten. Die fernen Ansichten zeigen das zusammengeführte Bild. Drei Gruppen (Gruppen I-III) sind ebenfalls in der Legende zu Fig. S4. Beachten Sie, dass α-Tubulin hauptsächlich im Axon nachgewiesen wird, obwohl es auch im zentralen Bereich des Wachstumskegels nachweisbar ist. Siehe Tabelle 1 für eine detaillierte Charakterisierung jedes Proteins und abgekürzte Namen. (Skalenbalken: 10 µm.)
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Tabelle 1.
Neuartige Kandidaten für nGAPs
Die meisten der in Abb. 3A zeigten bisher unentdeckte Assoziationen mit Wachstumskegeln und waren funktionell verwandt (Tabelle 1). Sept2, Cap1 (ein G-Aktin-bindendes Protein), Snap25a und Cyfip1 wurden vorgeschlagen, um Rollen im Wachstum Kegel Verhalten zu spielen, basierend auf Studien in PC12-Zellen oder Küken oder Drosophila Neuronen (21-24), aber ihre genauen Rollen in der Säugetier-Wachstum Kegel sind nicht bekannt. Für die beiden GTP-bindenden Proteine (Gnai2, Gnao1) und den Regulator (Farp2) wurde eine Beteiligung an der Regulation einer Wachstumskegelantwort auf Inhibitoren berichtet, obwohl nicht bekannt ist, ob sie für das axonale Wachstum notwendig oder unverzichtbar sind (25-27). Nach unserem besten Wissen wurde zuvor berichtet, dass keines der anderen 10 Proteine Wachstumskegelregulatoren in Säugetierzellen oder wirbellosen Modellorganismen wie C. elegans oder Drosophila ist, obwohl ihre Paralogue möglicherweise mit dem Neuritenwachstum zusammenhängen . Die aktuellen Informationen zu diesen Proteinen fassen wir in Tabelle 1 kurz zusammen. Höchstens 3 der 17 Proteine, die in unserer Studie identifiziert und mit RNAi getestet wurden, waren zuvor am axonalen Wachstum beteiligt, was darauf hindeutet, dass es uns gelungen ist, zusätzliche Moleküle, die an Wachstumskegelfunktionen beteiligt sind, effizient zu identifizieren. Insgesamt deuten die Ergebnisse der RNAi-Analyse auf 17 Proteine mit höheren oder ähnlichen FI-Verhältnissen als GAP-43 hin, was sie zu starken Kandidaten für neuartige neuronale wachstumsassoziierte Proteine (nGAPs; refs. 4 und 30).
Der Wachstumskegel besteht aus morphologisch und funktionell unterschiedlichen Regionen, die als zentrale (C) und periphere (P) Regionen (31) bezeichnet werden. Die C-Region ist an Vesikeln und Mikrotubuli angereichert und wahrscheinlich an der Membranexpansion für das axonale Wachstum beteiligt. Die P-Region ist mit Aktinfilamenten angereichert und erzeugt wahrscheinlich Antriebskraft. Verwendung von Tubulin als Marker für die C-Region (siehe Abb. S3) klassifizierten wir die Markerproteine in vier Gruppen: Gruppe I, vorwiegend in der P-Region lokalisiert; Gruppe II, in beiden Regionen nachgewiesen; Gruppe III, vorwiegend in der C-Region lokalisiert; und Gruppe IV, spezifisch in der C-Region lokalisiert (Abb. 3B; siehe auch Fig. S3 und S4).
Die von uns beobachteten Lokalisierungsmuster unterschieden sich etwas von dem, was vorhergesagt worden sein könnte. Beispielsweise wurde berichtet, dass Pacs1 an der Organellensortierung beteiligt ist, aber in Axonen lokalisiert sich Pacs1 in der P-Region, wo F-Aktin angereichert ist (Abb. 3B). Ein mutmaßliches lösliches Adapterprotein, Strap, von dem berichtet wurde, dass es der TGF-β-Signalisierung nachgeschaltet ist (32), und Clptm1, ein unbekanntes Transmembranprotein (33), sind ebenfalls in der P-Region lokalisiert. Im Gegensatz dazu wird Sept 2 in der Nähe der Tubulin-positiven Region nachgewiesen, obwohl zuvor berichtet wurde, dass es in der P-Domäne in PC12-Zellen gefunden wurde (21). Nur Rtn1, ein ER-Protein und mutmaßlicher Membrantransportregulator (34), wurde spezifisch in der C-Region lokalisiert, was es potenziell als C-Regionsmarker nützlich macht.
