- Resultados
- Identificación a gran Escala de Proteínas en Conos de Crecimiento Cerebral de Ratas.
- La Verificación de la Localización del Cono de Crecimiento Sugiere una Tasa Insignificante de Falsos Positivos.
- Proteínas Más Concentradas en el Cono de Crecimiento Que en el Axón Distal.
- El Análisis de ARNi Revela Relevancia para la Longitud del Axón y los Marcadores Funcionales del Cono de Crecimiento.
Resultados
Identificación a gran Escala de Proteínas en Conos de Crecimiento Cerebral de Ratas.
Nuestro primer objetivo fue identificar un gran número de proteínas expresadas en conos de crecimiento, incluidas proteínas comunes a muchos tipos de células y proteínas involucradas en funciones específicas de conos de crecimiento. Para hacer esto, primero separamos las proteínas del cerebro anterior de rata en desarrollo a través del fraccionamiento subcelular para obtener una fracción de GCP (Fig. 1A). Luego obtuvimos un MCG a través del tratamiento hipotónico de la fracción de PCG (ver detalles en el texto del SI) con el objetivo de identificar proteínas de membrana menores en el cono de crecimiento. Posteriormente, utilizamos cromatografía líquida multidimensional-espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS) para identificar proteínas únicas en la muestra, porque se ha demostrado que el método es adecuado para la identificación de proteínas a gran escala (15, 16). El método también demostró ser poderoso en este estudio, con un total de 945 especies de proteínas identificadas en GCP y GCM (Fig. 1B). Debido a que se sabía que <50 de las proteínas se expresaban previamente en el cono de crecimiento de los mamíferos, la identificación de este gran número de proteínas proporciona una gran cantidad de información molecular sobre los conos de crecimiento de los mamíferos (2, 4, 17). Para la comparación, también analizamos los sinaptosomas adultos, la contraparte del cono de crecimiento, e identificamos 1.407 especies de proteínas sinaptosómicas (es decir, el doble de las que encontramos para el GCP y el GCM). Aproximadamente el 65% de las proteínas sinaptosómicas que identificamos no se encuentran en los conjuntos de GCP o GCM (Fig. 1C), que puede deberse a que un gran número de proteínas se sintetizan nuevamente y se agregan a los componentes sinápticos para la transmisión sináptica después de la sinaptogénesis. Logramos identificar 96 y 141 proteínas en el GCP o GCM, respectivamente, que no se encontraban en los sinaptosomas (Fig. 1C).
La Verificación de la Localización del Cono de Crecimiento Sugiere una Tasa Insignificante de Falsos Positivos.
A continuación, queríamos determinar la especificidad de nuestro enfoque proteómico, es decir, determinar la tasa de falsos positivos. En general, se debe hacer una comparación de una fracción dada con otra fracción bioquímica. Sin embargo, no se pueden preparar fracciones del cerebro en desarrollo con una pureza comparable a las fracciones de GCP o GCM. Por lo tanto, para facilitar la generación de un conjunto de datos de comparación, realizamos una inmunodetección sistemática de un subconjunto de proteínas en neuronas corticales cultivadas (ver Tabla S4, Tabla S5, Tabla S6 y Tabla S7). Excluimos las proteínas ubicuas o comúnmente expresadas, como las enzimas metabólicas y las acompañantes moleculares, para poder centrarnos en las proteínas que pueden ser particularmente relevantes para las funciones específicas de los conos de crecimiento. En total, observamos las distribuciones de 131 proteínas (es decir, ≈15% de las proteínas que identificamos). Los datos confirman que en las neuronas corticales de rata cultivadas, todas las proteínas que probamos son detectables en el área del cono de crecimiento (Fig. 2 y cuadro S4). De hecho, no se detectaron proteínas que probamos en otras regiones axonales, pero no en el cono de crecimiento, lo que sugiere una tasa de falsos positivos muy baja y valida nuestro enfoque general. Además, nuestros datos proteómicos en GCP o GCM no contenían factores de transcripción, lo que sugiere que la contaminación con componentes nucleares también es insignificante (Fig. 1D, cuadro S1 y cuadro S2).
Fig. 2.
Cuantificación de inmunofluorescencia de PCG. Eje horizontal, relación FI (cono de crecimiento/axón distal), Eje longitudinal, relación de área (cono de crecimiento/axón distal). El eje horizontal muestra el índice de acumulación de CG (una relación de 1,0; la línea punteada negra vertical indica que una proteína dada está distribuida uniformemente en el axón distal versus el cono de crecimiento). La relación FI para GAP-43 (Gap43; 1.315) se muestra como una línea de puntos azul. Las proteínas en la región superior derecha del gráfico están más concentradas en el cono de crecimiento que en el axón. Muchas de ellas son proteínas de unión a actina y proteínas implicadas en el tráfico vesicular. La relación FI de cada proteína se probó utilizando la prueba estadística de Kruskal-Willis (46) con GAP-43 como punto de comparación. Las proteínas se agruparon en función del intervalo de confianza de dos lados del 95%, es decir, si era más alto, similar o menor que el de GAP-43 (mostrado en rojo, azul y negro, respectivamente). Tenga en cuenta que, como se esperaba, la actina F (detectada con faloidina de rodamina; en rojo), que se concentra en el cono de crecimiento, y la tubulina β (verde), que se encuentra en niveles más altos en el axón que en el cono de crecimiento, están distantes entre sí en el gráfico. Véase el cuadro S4 para obtener información detallada.
Proteínas Más Concentradas en el Cono de Crecimiento Que en el Axón Distal.
A continuación, buscamos determinar el grado en que las proteínas identificadas en nuestro estudio son específicas o localmente específicas para el cono de crecimiento. Para ello, comparamos las distribuciones de las proteínas en conos de crecimiento con su distribución en axones distales. En la medida en que el método es cuantitativo, también pudimos comparar las concentraciones relativas de proteínas en conos de crecimiento versus axones distales (Fig. 2 y cuadro S4). Definimos el índice de acumulación del cono de crecimiento como la relación de intensidad de fluorescencia (FI) en el cono de crecimiento en comparación con la del axón distal (Fig. 2, Tabla S4, Texto del SI y Fig. S1). También utilizamos otro índice, es decir, la razón de área, para examinar los patrones de distribución de cada proteína (Fig. S2). El índice de acumulación del cono de crecimiento es una indicación del nivel relativo de acumulación de proteínas en el cono de crecimiento. Al aplicar la prueba estadística de suma de rangos de Wilcoxon a nuestros resultados, facilitando una clasificación estricta de las proteínas examinadas en comparación con GAP-43, nuestra cuantificación del enfoque sistemático de inmunotinción utilizando este índice reveló que se detectaron hasta 69 proteínas identificadas por proteómica en niveles más altos en el área del cono de crecimiento que en el axón distal. Estas proteínas parecen estar en niveles mucho más altos en los conos de crecimiento que el marcador de cono de crecimiento establecido actualmente GAP-43 (7) (Fig. 2, en rojo). También encontramos que para 33 proteínas las áreas de error estadístico se superponen con la de GAP-43, por lo que clasificamos este conjunto de proteínas como concentradas en el cono de crecimiento en un grado similar al de GAP-43 (Fig. 2, en azul).
El Análisis de ARNi Revela Relevancia para la Longitud del Axón y los Marcadores Funcionales del Cono de Crecimiento.
Utilizamos un enfoque basado en ARNi para probar el papel de los candidatos a proteínas marcadores en el crecimiento axonal. El crecimiento axonal inductor de actividad se evaluó midiendo la longitud axonal (ver Texto del SI; para la confirmación de la caída y la especificidad, ver también la Fig. S1). Seleccionamos 68 genes para el tratamiento del ARNi y encontramos que la interrupción de 17 de ellos condujo a una longitud axonal más corta, mediante la aplicación de una prueba estricta no paramétrica, es decir, la prueba de Kruskal-Willis (Fig. 3A, cuadro 1 y cuadro S8). Categorizamos las 17 proteínas como marcadores supuestas de cono de crecimiento funcional (Tabla 1). Considerando los resultados de la inmunotinción cuantitativa (Fig. 2), estas proteínas se pueden clasificar en proteínas más concentradas que GAP-43 (las proteínas se muestran en rojo en la Fig. 2) o similar a GAP-43 (las proteínas se muestran en azul en la Fig. 2). De estas 17 proteínas, hay cinco proteínas citoesqueléticas (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb y Sept 2), cuatro proteínas de tráfico de membrana (Pacs1, Stx7, Snap25a y Rtn1), dos proteínas de unión a GTP (Gnai2, Gnao1), dos proteínas involucradas en la señalización de proteínas G pequeñas (Farp2 y Cyfip1), tres proteínas adaptadoras de señalización (Strap, FABP7 y Crmp1) y un candidato a receptor (Clptm1).
Fig. 3.
Identificación de NGAP por ARNi. A) Genes que afectan al crecimiento axonal. Los roles de las proteínas identificadas en la actividad del cono de crecimiento se evaluaron buscando la reducción del crecimiento axonal inducida por ARNi. El ARNI se realizó según lo descrito (45). Las ocho proteínas a la izquierda de la línea eclosionada tienen relaciones FI superiores a GAP-43, según se juzga estadísticamente mediante el uso de la prueba de Kruskal-Willis (rojo; también se muestra en rojo en la Fig. 2), y las nueve proteínas a la derecha de la línea eclosionada tienen proporciones de FI similares a la de GAP-43, según se juzga por la misma prueba. Las longitudes axonales de neuronas EGFP positivas (sin siRNA) se utilizaron como control (azul; también se muestra en azul en la Fig. 2). Todos los siRNAs (excepto GFP) tienen P < 0,002 en la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (vs.control) (46). Los datos se muestran como media ± SEM. El número de neuronas medidas se muestra en la parte inferior de cada barra. B) Clasificación de posibles proteínas marcadores de cono de crecimiento por inmunolocalización. Definimos los dominios C y P de un cono de crecimiento mediante el análisis cuantitativo de imágenes de inmunotinción (diagrama en la parte superior; ver Texto del SI y Fig. S2). Clasificamos las proteínas en cuatro grupos: grupo I (ej. Pacs1), predominantemente localizada en la región P (C P); grupo II (ej. Syx7), detectado en las regiones C y P( C P P); grupo III (ej. Gnai2), predominantemente localizada en la región C ( C P P); y grupo IV (ej. Rtn1), localizada específicamente en la región C (C). En cada caso, el diagrama de la izquierda es un resumen de una distribución típica de proteínas para cada grupo. Las micrografías de inmunofluorescencia de la detección de anticuerpos anti-proteína de los anticuerpos del anticandidato en neuronas corticales de rata cultivadas se muestran en las vistas de A. Magenta y verde de la proteína del antígeno y de la α-tubulina, respectivamente. Las vistas lejanas muestran la imagen fusionada. Tres grupos (grupos I-III) también se muestran en la leyenda de la Fig. S4. Nótese que la α-tubulina se detecta principalmente en el axón, aunque también es detectable en la región central del cono de crecimiento. Ver Tabla 1 para una caracterización detallada de cada proteína y nombres abreviados. (Barras de escala: 10 µm.)
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Tabla 1.
Nuevos candidatos para NGAP
La mayoría de los candidatos enumerados en la Fig. 3A reveló asociaciones previamente no detectadas con conos de crecimiento y estaban relacionadas funcionalmente (Tabla 1). Se ha sugerido que Sept2, Cap1 (una proteína de unión a G-actina), Snap25a y Cyfip1 desempeñan funciones en el comportamiento del cono de crecimiento, según estudios en células PC12 o neuronas de pollito o Drosófila (21-24), pero no se conocen sus funciones precisas en el cono de crecimiento de los mamíferos. Para las dos proteínas de unión al GTP (Gnai2, Gnao1) y el regulador (Farp2), se ha reportado participación en la regulación de la respuesta del cono de crecimiento a los inhibidores, aunque no se sabe si son necesarios o indispensables para el crecimiento axonal (25-27). Hasta donde sabemos, ninguna de las otras 10 proteínas se reportó previamente como reguladores del cono de crecimiento en células de mamíferos o en organismos modelo de invertebrados como C. elegans o Drosophila, aunque sus análogos pueden estar relacionados con el crecimiento de neuritas . Resumimos brevemente la información actual sobre estas proteínas en la Tabla 1. Como máximo, 3 de las 17 proteínas identificadas en nuestro estudio y probadas con ARNi han estado implicadas previamente en el crecimiento axonal, lo que sugiere que logramos identificar eficientemente moléculas adicionales involucradas en las funciones del cono de crecimiento. En total, los resultados del análisis de ARNi apuntan a 17 proteínas con proporciones de FI más altas o similares que GAP-43, lo que las convierte en fuertes candidatas para nuevas proteínas asociadas al crecimiento neuronal (nGAPs; refs. 4 y 30).
El cono de crecimiento está compuesto por regiones morfológica y funcionalmente distintas denominadas regiones central (C) y periférica (P) (31). La región C está enriquecida en vesículas y microtúbulos y probablemente participa en la expansión de la membrana para el crecimiento axonal. La región P está enriquecida en filamentos de actina y probablemente genera fuerza motriz. Usando tubulina como marcador para la región C (ver Fig. S3), clasificamos las proteínas marcadores en cuatro grupos: grupo I, localizado predominantemente en la región P; grupo II, detectado en ambas regiones; grupo III, localizado predominantemente en la región C; y grupo IV, localizado específicamente en la región C (Fig. 3B; ver también Figs. S3 y S4).
Los patrones de localización que observamos fueron algo diferentes de lo que se podría haber predicho. Por ejemplo, se ha informado que Pacs1 está involucrado en la clasificación de orgánulos, pero en los axones, Pacs1 se localiza en la región P, donde se enriquece la actina F (Fig. 3B). Una proteína adaptadora soluble putativa, Strap, que ha sido reportada aguas abajo de la señalización TGF-β (32), y Clptm1, una proteína transmembrana desconocida (33), también están localizadas en la región P. Por el contrario, el 2 de septiembre se detecta cerca de la región de tubulina positiva a pesar de que se informó previamente que se encontraba en el dominio P en células PC12 (21). Solo el Rtn1, un regulador de tráfico de membrana putativo y proteína de RE (34), se localizó específicamente en la región C, lo que lo hace potencialmente útil como marcador de la región C.
