Identification des protéines marqueurs fonctionnelles dans le cône de croissance des mammifères

La Vérification de la Localisation du Cône de Croissance Suggère un Taux de Faux Positifs Négligeable.

Nous avons ensuite voulu déterminer la spécificité de notre approche protéomique, c’est-à-dire déterminer le taux de faux positifs. Généralement, une comparaison d’une fraction donnée doit être faite avec une autre fraction biochimique. Cependant, aucune fraction du cerveau en développement ne peut être préparée avec une pureté comparable aux fractions GCP ou GCM. Ainsi, pour faciliter la génération d’un ensemble de données de comparaison, nous avons effectué une immunodétection systématique d’un sous-ensemble de protéines dans des neurones corticaux en culture (voir Tableau S4, Tableau S5, Tableau S6 et Tableau S7). Nous avons exclu les protéines ubiquitaires ou couramment exprimées telles que les enzymes métaboliques et les chaperons moléculaires afin que nous puissions plutôt nous concentrer sur les protéines qui peuvent être particulièrement pertinentes pour les fonctions spécifiques des cônes de croissance. Au total, nous avons examiné les distributions de 131 protéines (c’est-à-dire ≈15% des protéines que nous avons identifiées). Les données confirment que dans les neurones corticaux de rat en culture, toutes les protéines que nous avons testées sont détectables dans la zone du cône de croissance (Fig. 2 et Tableau S4). En effet, aucune protéine que nous avons testée n’a pu être détectée dans d’autres régions axonales mais pas dans le cône de croissance, suggérant un taux de faux positifs très faible et validant notre approche globale. De plus, nos données protéomiques dans GCP ou GCM ne contenaient aucun facteur de transcription, ce qui suggère que la contamination par des composants nucléaires est également négligeable (Fig. 1D, Tableau S1 et Tableau S2).

Protéines Plus concentrées dans le Cône de Croissance Que dans l’Axone Distal.

Nous avons ensuite cherché à déterminer dans quelle mesure les protéines identifiées dans notre étude sont spécifiques ou localement spécifiques au cône de croissance. Pour ce faire, nous avons comparé les distributions des protéines dans les cônes de croissance avec leur distribution dans les axones distaux. Dans la mesure où la méthode est quantitative, nous avons également pu comparer les concentrations relatives de protéines dans les cônes de croissance par rapport aux axones distaux (Fig. 2 et Tableau S4). Nous avons défini l’indice d’accumulation du cône de croissance comme le rapport de l’intensité de fluorescence (FI) dans le cône de croissance par rapport à celle de l’axone distal (Fig. 2, Tableau S4, Texte SI et Fig. S1). Nous avons également utilisé un autre indice, c’est-à-dire le rapport de surface, pour examiner les schémas de distribution de chaque protéine (Fig. S2). L’indice d’accumulation du cône de croissance est une indication du niveau relatif d’accumulation de protéines dans le cône de croissance. En appliquant le test statistique de somme de rang de Wilcoxon à nos résultats, facilitant une classification stricte des protéines examinées par rapport à GAP-43, notre quantification de l’approche d’immunomarquage systématique utilisant cet indice a révélé que jusqu’à 69 protéines identifiées par la protéomique ont été détectées à des niveaux plus élevés dans la zone du cône de croissance que dans l’axone distal. Ces protéines semblent être à des niveaux beaucoup plus élevés dans les cônes de croissance que la protéine marqueur de cône de croissance GAP-43(7) actuellement établie (Fig. 2, en rouge). Nous avons également constaté que pour 33 protéines, les zones d’erreur statistique se chevauchent avec celle de GAP-43, nous classons donc cet ensemble de protéines comme concentrées dans le cône de croissance à un degré similaire à celui de GAP-43 (Fig. 2, en bleu).

L’analyse de l’ARNi Révèle une pertinence pour la Longueur de l’Axone et les Marqueurs Fonctionnels du Cône de croissance.

Nous avons utilisé une approche basée sur l’ARNi pour tester les rôles des protéines candidates marqueurs dans la croissance axonale. La croissance axonale induisant une activité a été évaluée en mesurant la longueur axonale (voir Texte SI; pour la confirmation du knockdown et de la spécificité, voir également Fig. S1). Nous avons sélectionné 68 gènes pour le traitement de l’ARNi et avons constaté que la perturbation de 17 d’entre eux conduisait à une longueur axonale plus courte, par application d’un test non paramétrique rigoureux, c’est-à-dire le test de Kruskal-Willis (Fig. 3A, Tableau 1 et Tableau S8). Nous classons les 17 protéines comme marqueurs fonctionnels putatifs du cône de croissance (tableau 1). Considérant les résultats de l’immunomarquage quantitatif (Fig. 2), ces protéines peuvent être classées en protéines plus concentrées que GAP-43 (protéines représentées en rouge sur la Fig. 2) ou similaire à GAP-43 (protéines représentées en bleu sur la Fig. 2). Parmi ces 17 protéines, il y a cinq protéines cytosquelettiques (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb et Sept 2), quatre protéines de trafic membranaire (Pacs1, Stx7, Snap25a et Rtn1), deux protéines de liaison au GTP (Gnai2, Gnao1), deux protéines impliquées dans la signalisation des petites protéines G (Farp2 et Cyfip1), trois protéines d’adaptateur de signalisation (Strap, FABP7 et Crmp1) et un candidat récepteur (Clptm1).

La plupart des candidats énumérés à la Fig. 3A a révélé des associations non détectées auparavant avec des cônes de croissance et étaient fonctionnellement liées (tableau 1). Sept2, Cap1 (une protéine de liaison à l’actine G), Snap25a et Cyfip1 ont été suggérés pour jouer un rôle dans le comportement du cône de croissance, sur la base d’études sur des cellules PC12 ou des neurones de poussin ou de Drosophile (21-24), mais leurs rôles précis dans le cône de croissance des mammifères ne sont pas connus. Pour les deux protéines de liaison au GTP (Gnai2, Gnao1) et le régulateur (Farp2), une implication dans la régulation d’une réponse du cône de croissance aux inhibiteurs a été rapportée, bien qu’on ne sache pas si elles sont nécessaires ou indispensables à la croissance axonale (25-27). À notre connaissance, aucune des 10 autres protéines n’a été rapportée auparavant comme étant des régulateurs de cônes de croissance dans des cellules de mammifères ou des organismes modèles d’invertébrés tels que C. elegans ou Drosophila, bien que leurs paralogues puissent être liés à la croissance des neurites. Nous résumons brièvement les informations actuelles sur ces protéines dans le tableau 1. Au plus 3 des 17 protéines identifiées dans notre étude et testées avec l’ARNi ont déjà été impliquées dans la croissance axonale, ce qui suggère que nous avons réussi à identifier efficacement des molécules supplémentaires impliquées dans les fonctions des cônes de croissance. Au total, les résultats de l’analyse de l’ARNi indiquent 17 protéines avec des rapports FI supérieurs ou similaires à ceux de GAP-43, ce qui en fait des candidats solides pour de nouvelles protéines associées à la croissance neuronale (NGAP; refs. 4 et 30).

Le cône de croissance est composé de régions morphologiquement et fonctionnellement distinctes appelées régions centrale (C) et périphérique (P) (31). La région C est enrichie en vésicules et microtubules et est probablement impliquée dans l’expansion membranaire pour la croissance axonale. La région P est enrichie en filaments d’actine et génère probablement une force motrice. En utilisant la tubuline comme marqueur pour la région C (voir Fig. S3), nous avons classé les protéines marqueurs en quatre groupes : le groupe I, localisé principalement dans la région P; le groupe II, détecté dans les deux régions; le groupe III, localisé principalement dans la région C; et le groupe IV, spécifiquement localisé dans la région C (Fig. 3B; voir aussi Fig. S3 et S4).

Les modèles de localisation que nous avons observés étaient quelque peu différents de ce qui aurait pu être prédit. Par exemple, il a été rapporté que Pacs1 était impliqué dans le tri des organites, mais dans les axones, Pacs1 se localise dans la région P, où la F-actine est enrichie (Fig. 3B). Une protéine adaptatrice soluble présumée, Strap, qui a été signalée en aval de la signalisation TGF-β (32), et Clptm1, une protéine transmembranaire inconnue (33), sont également localisées dans la région P. En revanche, Sept 2 est détecté près de la région tubuline positive malgré le fait qu’il ait été précédemment signalé dans le domaine P dans les cellules PC12 (21). Seule la Rtn1, une protéine ER et un régulateur présumé du trafic membranaire (34), a été spécifiquement localisée dans la région C, ce qui la rend potentiellement utile comme marqueur de la région C.