Funkcionális marker fehérjék azonosítása az emlősök növekedési kúpjában

a növekedési kúp lokalizációjának ellenőrzése elhanyagolható hamis pozitív arányra utal.

ezután meg akartuk határozni a proteomikai megközelítésünk specifitását, azaz a hamis pozitív arány meghatározását. Általában egy adott frakció összehasonlítását egy másik biokémiai frakcióval kell elvégezni. A fejlődő agyból azonban egyetlen frakció sem állítható elő a GCP vagy GCM frakciókhoz hasonló tisztasággal. Így az összehasonlító adatkészlet létrehozásának megkönnyítése érdekében szisztematikusan elvégeztük a fehérjék egy részhalmazának immundetektálását a tenyésztett kortikális neuronokban (lásd az S4 táblázatot, az S5 táblázatot, az S6 táblázatot és az S7 táblázatot). Kizártuk a mindenütt jelenlévő vagy gyakran expresszált fehérjéket, például a metabolikus enzimeket és a molekuláris chaperonokat, hogy ehelyett olyan fehérjékre koncentrálhassunk, amelyek különösen fontosak lehetnek a növekedési kúp-specifikus funkciók szempontjából. Összesen 131 fehérje eloszlását vizsgáltuk(azaz az általunk azonosított fehérjék 15% – át). Az adatok megerősítik, hogy a tenyésztett patkány kortikális neuronokban az összes vizsgált fehérje kimutatható a növekedési kúp területén (ábra. 2 és S4 táblázat). Valójában egyetlen általunk vizsgált fehérjét sem lehetett kimutatni más axonális régiókban, de a növekedési kúpban nem, ami nagyon alacsony hamis pozitív arányra utal, és igazolja általános megközelítésünket. Ezenkívül a GCP-ben vagy a GCM-ben szereplő proteomikus adataink nem tartalmaztak transzkripciós faktorokat, ami arra utal, hogy a nukleáris komponensekkel való szennyeződés is elhanyagolható (ábra. 1D, S1 táblázat és S2 táblázat).

a fehérjék koncentráltabbak a növekedési kúpban, mint a disztális axonban.

ezután arra törekedtünk, hogy meghatározzuk, hogy a vizsgálatunkban azonosított fehérjék milyen mértékben specifikusak vagy lokálisan specifikusak a növekedési kúpra. Ehhez összehasonlítottuk a fehérjék eloszlását a növekedési kúpokban a disztális axonokban való eloszlásukkal. Amennyiben a módszer kvantitatív, képesek voltunk összehasonlítani a fehérjék relatív koncentrációját a növekedési kúpokban a disztális axonokkal szemben (ábra. 2 és S4 táblázat). A növekedési kúp felhalmozódási indexét a növekedési kúp fluoreszcencia intenzitásának (FI) arányaként határoztuk meg a disztális axonéhoz képest (ábra. 2, táblázat S4, SI szöveg, ábra. S1). Egy másik indexet is használtunk, azaz a területarányt, hogy megvizsgáljuk az egyes fehérjék eloszlási mintáit (ábra. S2). A növekedési kúp felhalmozódási indexe a fehérje felhalmozódásának relatív szintjét jelzi a növekedési kúpban. A statisztikai Wilcoxon rank-sum teszt alkalmazásával eredményeinkre, megkönnyítve a vizsgált fehérjék szigorú osztályozását a GAP-43-hoz képest, a szisztematikus immunfestő megközelítés ezen index felhasználásával történő számszerűsítése során kiderült, hogy akár 69 a proteomikával azonosított fehérjéket magasabb szinten detektálták a növekedési kúp területén, mint a disztális axonban. Úgy tűnik, hogy ezek a fehérjék sokkal magasabb szinten vannak a növekedési kúpokban, mint a jelenleg létrehozott növekedési kúp marker fehérje GAP-43 (7) (ábra. 2, piros színnel látható). Azt is megállapítottuk, hogy 33 fehérje esetében a statisztikai hibaterületek átfedésben vannak a GAP-43-mal, így ezt a fehérjehalmazt a növekedési kúpban koncentráltként kategorizáljuk hasonló mértékben, mint a GAP-43 (ábra. 2, kék színnel látható).

az RNAi-analízis feltárja a növekedési kúp Axonhosszának és funkcionális markereinek relevanciáját.

RNS-alapú megközelítést alkalmaztunk a marker fehérje jelöltek szerepének tesztelésére az axonális növekedésben. Az aktivitást indukáló axonális növekedést az axonális hossz mérésével értékeltük (lásd az SI szöveget; a leütés és a specifitás megerősítését lásd az ábrán is. S1). 68 gént választottunk ki az RNS-kezelésre, és megállapítottuk, hogy 17 közülük rövidebb axonális hosszhoz vezetett, szigorú nemparaméteres teszt alkalmazásával, azaz a Kruskal-Willis teszt (ábra. 3A, 1. táblázat és S8. táblázat). A 17 fehérjét feltételezett funkcionális növekedési kúp markerként kategorizáljuk (1.táblázat). Figyelembe véve a kvantitatív immunfestés eredményeit (ábra. 2), Ezek a fehérjék koncentráltabb fehérjékbe sorolhatók, mint a GAP-43 (Az ábrán piros színnel látható fehérjék. 2) vagy hasonló GAP-43 (fehérjék látható kék ábrán. 2). E 17 fehérje közül öt citoszkeletális fehérje (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb és szeptember 2), négy membránkereskedelmi fehérje (Pacs1, Stx7, Snap25a és Rtn1), két GTP-kötő fehérje (Gnai2, Gnao1), két fehérje, amely részt vesz a kis G-fehérje jelátvitelében (Farp2 és Cyfip1), három jelző adapter fehérje (Strap, FABP7 és Crmp1), és egy receptor jelölt (Clptm1).

ábrán felsorolt jelöltek többsége. A 3A korábban nem észlelt asszociációkat tárt fel a növekedési kúpokkal, amelyek funkcionálisan összefüggenek (1. táblázat). A SEPT2, a Cap1 (egy G-aktin-kötő fehérje), a Snap25a és a Cyfip1 a PC12 sejtekben vagy a chick vagy Drosophila neuronokban (21-24) végzett vizsgálatok alapján javasolták, hogy szerepet játszanak a növekedési kúp viselkedésében, de pontos szerepük az emlős növekedési kúpban nem ismert. A két GTP-kötő fehérje (Gnai2, Gnao1) és a szabályozó (Farp2) esetében beszámoltak az inhibitorokra adott növekedési kúp válasz szabályozásában való részvételről, bár nem ismert, hogy ezek szükségesek vagy nélkülözhetetlenek-e az axonális növekedéshez (25-27). Legjobb tudomásunk szerint, a többi 10 fehérje közül korábban nem számoltak be növekedési kúp szabályozókról emlős sejtekben vagy gerinctelen modellszervezetekben, mint például a C. elegans vagy a Drosophila, bár paralógjaik kapcsolatban lehetnek a neurit növekedésével . Röviden összefoglaljuk a fehérjékkel kapcsolatos aktuális információkat az 1. táblázatban. A vizsgálatunkban azonosított és RNSi-vel tesztelt 17 fehérje közül legfeljebb 3 korábban érintett volt az axonális növekedésben, ami arra utal, hogy sikerült hatékonyan azonosítani a növekedési kúp funkcióiban részt vevő további molekulákat. Összességében az RNS-elemzés eredményei 17 fehérjére mutatnak, amelyek magasabb vagy hasonló FI-arányúak, mint a GAP-43, így erős jelöltek az új neuronális növekedéshez kapcsolódó fehérjékre (nGAPs; refs. 4. és 30.).

a növekedési kúp morfológiailag és funkcionálisan különálló régiókból áll, amelyeket központi (C) és perifériás (P) régióknak neveznek (31). A C régió vezikulumokban és mikrotubulusokban gazdagodik, és valószínűleg részt vesz a membrán expanziójában az axonális növekedés érdekében. A P régió aktinszálakban dúsul, és valószínűleg mozgatóerőt generál. A tubulin használata a C régió markereként (Lásd az ábrát. S3), a marker fehérjéket négy csoportba soroltuk:I. csoport, elsősorban a P régióban lokalizálva; II. csoport, mindkét régióban kimutatható; III. csoport, túlnyomórészt a C régióban lokalizálva; és IV. csoport, kifejezetten a C régióban lokalizálva (ábra. 3B; Lásd még füge. S3 és S4).

az általunk megfigyelt lokalizációs minták némileg eltérnek attól, amit előre jeleztek. Például a Pacs1-ről beszámoltak arról, hogy részt vesz az organellák rendezésében, de axonokban a Pacs1 a P régióba lokalizálódik, ahol az F-aktin dúsul (ábra. 3B). Egy feltételezett oldható adapterfehérje, a Strap, amelyről a TGF-62 jelátvitel után beszámoltak, valamint a Clptm1, egy ismeretlen transzmembrán fehérje (33) szintén lokalizálódik a P régióban. Ezzel szemben a Sept 2-t a tubulin-pozitív régió közelében detektálják annak ellenére, hogy korábban arról számoltak be, hogy a PC12 sejtek P doménjében található (21). Csak az Rtn1, az ER fehérje és a feltételezett membránkereskedelem szabályozója (34) volt specifikusan lokalizálva a C régióban, ami potenciálisan hasznos lehet C-régió markerként.