La base genetica del melanismo adattivo nei topi tascabili

Risultati e discussione

I topi sono stati raccolti da sei siti in quattro regioni geografiche, inclusi substrati chiari e scuri (Fig. 1 BIS). In tutti i casi, abbiamo osservato una stretta corrispondenza tra il colore del substrato e il colore del pelaggio dorsale (Fig. 1 TER). I topi di Portal e Avra Valley erano uniformemente leggeri. Dei 29 topi del sito di Pinacate, 16 dei topi 18 (89%) catturati sulla lava scura erano scuri, mentre 10 dei topi 11 (91%) catturati sulle rocce di colore chiaro erano leggeri (Fig. 1 TER). Allo stesso modo, dei topi 20 di Armendaris, 7 dei topi 8 (88%) catturati sulla lava scura erano scuri, mentre tutti i topi 12 (100%) catturati sulle rocce di colore chiaro erano leggeri. In queste popolazioni, la variazione fenotipica nel colore era in gran parte discreta piuttosto che quantitativa; tutti i topi erano facilmente classificati come leggeri o melanici in base alla presenza o all’assenza di una banda subterminale di feomelanina sui singoli peli sul dorso.

In linea di principio, sono possibili diversi approcci per identificare i geni alla base di un fenotipo di interesse. Tuttavia, C. intermedius sono difficili da allevare in cattività, e quindi qualsiasi approccio che si basa su croci non è pratico. Invece, abbiamo usato studi di associazione con geni candidati per identificare le mutazioni responsabili delle differenze fenotipiche osservate. Circa 1,5 kb di DNA intronico dal locus agouti sono stati sequenziati in 36 topi, inclusi rappresentanti di tutti i siti. La mutazione black-and-tan nel topo da laboratorio produce un dorso scuro con peli non fasciati ed è causata da un’inserzione che interrompe il promotore dorsale, ≈15 kb 5′ del codone iniziale (15). Abbiamo ragionato che una mutazione simile in C. intermedius potrebbe essere rilevata attraverso il collegamento a polimorfismi in siti neutri su distanze genomiche moderate (0-50 kb, a seconda dell’età della mutazione). Abbiamo osservato 16 polimorfismi a singolo nucleotide e 5 polimorfismi di inserzione/delezione, inclusi diversi a frequenze intermedie; nessuno ha mostrato un’associazione con il colore del mantello. Ci sono due possibili spiegazioni per questa mancanza di associazione: O agouti non è un determinante principale delle differenze fenotipiche osservate, o agouti è coinvolto, ma c’è poco o nessun squilibrio di collegamento tra i siti che abbiamo esaminato e il sito funzionale(s).

Entrambi gli alleli dell’intero gene Mc1r (954 bp) sono stati sequenziati nei topi 69 in Fig. 1. Sono stati osservati ventiquattro polimorfismi a singolo nucleotide: 15 erano sinonimi e 9 non sinonimi. Quattro dei nove polimorfismi aminoacidici sono stati osservati solo nei topi scuri della località di Pinacate (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp e Gln-233 → His). Queste quattro varianti di aminoacidi erano presenti ad alta frequenza (82%) tra i topi scuri Pinacate ed erano in completo squilibrio di collegamento tra loro. Tutti gli altri polimorfismi di aminoacidi Mc1r erano presenti a basse frequenze e non mostravano alcuna associazione con il colore del mouse. La distribuzione della variazione del nucleotide Mc1r tra topi leggeri e melanici dal sito del Pinacato è mostrata nella Tabella 1.

Diverse osservazioni suggeriscono che una o più di queste quattro mutazioni aminoacidiche (siti 18, 109, 160 e 233) sono responsabili delle differenze fenotipiche chiare/scure osservate nella popolazione di Pinacati. Innanzitutto, esiste una perfetta associazione tra genotipo e fenotipo (Tabella 2). In una singola popolazione panmictica senza accoppiamento assortativo, un’associazione tra variazione genotipica e fenotipica è inaspettata a meno che il gene o un gene strettamente collegato sia responsabile del fenotipo. Tuttavia, la struttura della popolazione può produrre un’associazione spuria anche quando un gene non è coinvolto nelle differenze fenotipiche (19). Abbiamo testato questa ipotesi sequenziando i geni mitocondriali COIII e ND3 in tutti i topi della località di Pinacate (n = 29). Una filogenesi di questi geni mitocondriali mostra che gli aplotipi di topi chiari e scuri sono mescolati, non fornendo alcuna prova per la struttura della popolazione nascosta (Fig. 2). Poiché la maggior parte del flusso genico nel Chaetodipus è probabilmente mediata dai maschi (20) e poiché il genoma mitocondriale ha una dimensione effettiva della popolazione di un quarto della dimensione effettiva degli autosomi, il DNA mitocondriale fornisce un marker sensibile per rilevare la struttura della popolazione. Questi dati mtDNA forniscono anche ulteriori prove di selezione sulle differenze fenotipiche scuro / chiaro. Nella popolazione di Pinacate, la frequenza di topi scuri su substrato chiaro (9%) e la frequenza di topi scuri su substrato scuro (89%) possono essere utilizzate per stimare il grado di differenziazione della popolazione per le differenze fenotipiche tra queste due aree adiacenti . Questo valore è > 10 volte più grande del valore corrispondente per mtDNA, coerente con l’idea che la selezione stia guidando le differenze fenotipiche. Studi futuri basati su campioni più grandi che utilizzano questo approccio ci permetteranno di stimare l’entità della selezione da modelli di equilibrio migrazione–selezione.

In secondo luogo, tutte e quattro le sostituzioni nonsynonymous che mostrano un’associazione con il colore del mantello causano un cambiamento nella carica aminoacidica. Nei primi tre siti di aminoacidi (18, 109, 160), il cambiamento passa da un’arginina caricata positivamente a un amminoacido non caricato. Al quarto sito (233), una glutammina non caricata viene sostituita con un’istidina caricata positivamente. Inoltre, tutte e quattro le mutazioni si trovano in regioni funzionalmente importanti del recettore che possono essere coinvolte nelle interazioni con altre proteine. Due delle sostituzioni si trovano nelle regioni extracellulari (siti di aminoacidi 18 e 109) e due si trovano nelle regioni intracellulari (siti 160 e 233); nessuno si trova nei domini transmembrana del recettore (Fig. 3). Un certo numero di fenotipi scuri precedentemente descritti nel locus di estensione nel topo (16) e in altri organismi (21-25) sono dovuti a singole mutazioni aminoacidiche in MC1R, sebbene nessuna delle mutazioni descritte qui sia stata precedentemente riportata. Nel topo di laboratorio, il tabacco (Etob) e gli alleli oscuranti cupi (Eso) sono causati da mutazioni rispettivamente nei primi domini intracellulari e nei primi domini extracellulari. Etob codifica un recettore melanocortin-1 che rimane reattivo all’ormone stimolante α-melanociti ma è iperattivo, mentre l’Eso codifica un recettore costitutivamente attivo (16). Come l’allele Etob in Mus, il melanico C. intermedius riportato qui ha colore scuro limitato al dorso.

In terzo luogo, l’allele scuro è dominante sull’allele chiaro, coerente con le osservazioni delle mutazioni Mc1r nel topo (11, 16) e in altri organismi (21-25). Nel topo da laboratorio, le mutazioni di perdita di funzione a Mc1r sono recessive e danno luogo a un colore chiaro, mentre gli alleli di guadagno di funzione sono dominanti e danno luogo a un colore scuro (16). Tutti i topi eterozigoti osservati nel sito del Pinacato sono scuri con peli non fasciati e sono fenotipicamente simili ai topi scuri omozigoti.

Infine, il modello di variazione nucleotidica osservato tra gli alleli Mc1r dal sito del Pinacato suggerisce la recente azione di selezione positiva. Tredici siti polimorfici sono variabili tra gli aplotipi chiari, mentre solo un sito è variabile tra gli aplotipi scuri (Tabella 1). Il rapporto tra variante e siti invarianti è significativamente diverso tra alleli scuri e chiari (1/953 e 13/941, test esatto di Fisher, P < 0,01). Il livello medio di diversità nucleotidica tra alleli leggeri (π = 0.21%) è >10 volte maggiore della diversità nucleotidica tra gli alleli scuri (π = 0,01%). La variabilità ridotta osservata tra gli alleli Mc1r scuri è il modello previsto se la selezione ha recentemente fissato una sostituzione adattiva (26-28). Un singolo sito silenzioso (nucleotide 633) è in completo squilibrio di legame con le sostituzioni di aminoacidi presenti in tutti gli animali scuri; questo modello è coerente con l’autostop genetico di questo sito silenzioso sull’aplotipo selezionato. Tuttavia, due test standard di neutralità (29, 30) non riescono a rilevare la selezione su Mc1r nella popolazione di Pinacati, sia nel campione totale che nelle sottopopolazioni su substrato chiaro o scuro. Il test McDonald–Kreitman (29) confronta il rapporto tra cambiamenti sinonimi e non sinonimi all’interno e tra le specie; qui, questo rapporto è cambiato solo leggermente dalle quattro sostituzioni di aminoacidi che distinguono gli alleli Mc1r chiari e scuri. Il test HKA (30) confronta la variazione all’interno e tra le specie per due geni diversi (in questo caso, Mc1r e mtDNA); tuttavia, il livello di variabilità nucleotidica a Mc1r non è significativamente ridotto anche nella sottopopolazione su substrato scuro, a causa della presenza di eterozigoti Mc1r.

A causa del completo squilibrio di legame tra i siti di aminoacidi 18, 109, 160 e 233 (Tabella 1), i nostri dati non ci consentono di determinare i contributi relativi di ciascuno di questi siti alle differenze di colore osservate, né escludono la possibilità che un gene collegato sia responsabile delle differenze fenotipiche osservate. Quest’ultima possibilità sembra improbabile per le ragioni sopra descritte e anche perché nessun gene di pigmentazione candidato è strettamente legato a Mc1r negli esseri umani o Mus. Nel topo da laboratorio, i singoli cambiamenti di aminoacidi a Mc1r sono sufficienti per produrre un colore scuro (16). Studi funzionali che utilizzano costrutti Mc1r in un sistema di espressione in vitro possono essere utilizzati per misurare l’effetto relativo delle quattro mutazioni sull’attivazione del recettore. I risultati preliminari dei test cAMP indicano che l’allele scuro codifica un recettore iperattivo rispetto all’allele chiaro, fornendo un forte supporto per il ruolo di Mc1r nelle differenze fenotipiche osservate (H. E. H., H. Fujino, J. Regan e M. W. N., dati non pubblicati). Usando questo approccio con costrutti che contengono ciascuna delle quattro mutazioni individualmente e in combinazione, speriamo di distinguere tra due diversi modelli per l’evoluzione di Mc1r: (i) una singola differenza di aminoacidi è responsabile delle differenze fenotipiche osservate e le altre varianti di aminoacidi hanno fatto l’autostop con il sito selezionato, o (ii) due o più varianti di aminoacidi (che agiscono in modo additivo o epistatico) sono necessarie per produrre le differenze fenotipiche osservate.

Sorprendentemente, i dati presentati qui implicano cambiamenti di aminoacidi a Mc1r nel fenotipo scuro nella popolazione Pinacate ma non nella popolazione Armendaris. Solo un polimorfismo aminoacidico Mc1r (Ala-285 → Thr) è stato osservato tra i 40 alleli di Armendaris; questa variante era presente in 2 su 24 alleli nei topi chiari e 0 su 16 alleli nei topi scuri. Due polimorfismi silenziosi erano presenti a frequenze intermedie (48%) tra i 40 alleli Armendaris, ma nessuno dei due mostrava alcuna associazione con il colore del mouse. In effetti, le frequenze di questi polimorfismi erano molto simili tra topi scuri (50%) e leggeri (45%). L’assenza di un’associazione tra polimorfismi nucleotidici nella regione di codifica Mc1r e il colore del topo ad Armendaris rende anche improbabile che siti insuperabili nella regione del promotore siano responsabili delle differenze fenotipiche, a meno che lo squilibrio del legame decada estremamente rapidamente. La regione del promotore di Mc1r è stata ben caratterizzata sia nei topi (31) che negli esseri umani (32), e si trova ≈500 bp a monte del codone iniziale. In generale, i modelli di variazione del nucleotide nella regione di codifica di Mc1r nei campioni di Armendaris (sia chiaro che scuro), Portal e Avra Valley erano ineccepibili. I livelli di diversità nucleotidica variavano da 0,11% a 0,19%, simile al valore osservato per gli animali leggeri dal sito del Pinacato.

Il fatto che i quattro mutazioni visto in melanic Pinacate topi (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp, e Gln-233 → Sua) sono assenti nella melanic topi da Armendaris indica che un simile scuro fenotipo è evoluto in maniera indipendente su queste diverse colate di lava e lo ha fatto attraverso diversi cambiamenti genetici, anche se il gene(s) coinvolti nel Armendaris popolazione non sono ancora stati identificati. La base molecolare distinta per lo stesso fenotipo in due diverse popolazioni fornisce una forte evidenza per l’evoluzione fenotipica convergente su una scala temporale relativamente breve; entrambe le colate laviche hanno meno di un milione di anni.

Mentre le mutazioni di oscuramento Mc1r sono state identificate in altre specie (16, 21-25), il contesto ecologico per i cambiamenti non è compreso (24, 25) o è dovuto alla selezione artificiale (22, 23). I gufi sono importanti predatori di topi tascabili (8, 9) e sono noti per discriminare tra topi chiari e scuri su substrati chiari e scuri anche durante il foraggiamento notturno a bassa intensità luminosa (10). Pertanto, è probabile che i gufi svolgano un ruolo importante nella selezione per nascondere la colorazione. I dati qui riportati presentano un raro esempio dei cambiamenti molecolari alla base dell’adattamento in un ambiente ecologico semplice e naturale.