結果
ラット脳成長円錐におけるタンパク質の大規模な同定。
私たちの最初の目標は、多くの細胞型に共通するタンパク質や成長円錐特異的機能に関与するタンパク質を含む、成長円錐に発現する多数のタ これを行うために、まず、発生中のラット前脳から細胞内分画を介してタンパク質を分離し、GCP画分を得た（図。 1A）。 その後、成長円錐内のマイナーな膜タンパク質を同定することを目的として、GCP画分（SIテキストの詳細を参照）の低張処理を介してGCMを得た。 その後、この方法は大規模なタンパク質同定に適していることが示されているため、多次元液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC/MS/MS）を使用して、 この方法は、本研究においても強力であり、GCPおよびGCMにおいて同定されたタンパク質の合計945種（図10）であることが証明された（図10）。 1B）。 タンパク質の<50は、以前に哺乳類の成長円錐で発現されることが知られていたので、タンパク質のこの多数の同定は、哺乳類の成長円錐（2、4、17）につい 比較のために、我々はまた、大人のシナプトソーム、成長円錐の対応を分析し、シナプトソームタンパク質の1,407種を同定した（すなわち、我々はGCPとGCMのために見つ 我々が同定したシナプトソームタンパク質の約65％は、GCPまたはGCMセットでは見出されない（図。 これは、シナプス形成後のシナプス伝達のために多数のタンパク質が新たに合成され、シナプス成分に添加されるためである可能性がある。 GcpとGCMでは、シナプトソームには見られない96個のタンパク質と141個のタンパク質を同定することに成功しました(図1)。 1C）。
成長円錐の局在化の検証は、無視できる偽陽性率を示唆している。
次に、プロテオミクスアプローチの特異性、すなわち偽陽性率を決定することを望んでいました。 一般に、所与の画分の比較は、別の生化学的画分となされるべきである。 しかしながら、発達中の脳からの画分は、ＧＣＰまたはＧＣＭ画分と同等の純度で調製することができない。 したがって、比較データセットの生成を容易にするために、我々は、培養皮質ニューロンにおけるタンパク質のサブセットの系統的免疫検出を行った（表S4、表S5、表S6、および表S7を参照）。 代謝酵素や分子シャペロンなどのユビキタスまたは一般的に発現するタンパク質を除外し、成長円錐特異的機能に特に関連するタンパク質に焦点を当てることができました。 合計で、我々は131のタンパク質（すなわち、我々が同定したタンパク質の≥15％）の分布を調べた。 このデータは、培養されたラット皮質ニューロンにおいて、我々が試験したタンパク質のすべてが成長円錐領域で検出可能であることを確認する（Fig. および表Ｓ４）。 確かに、我々がテストしたタンパク質は、非常に低い偽陽性率を示唆し、我々の全体的なアプローチを検証し、他の軸索領域ではなく、成長円錐で検出するこ さらに、GCPまたはGCMのプロテオームデータには転写因子が含まれておらず、核成分による汚染も無視できることを示唆しています（図2）。 表Ｓ１、および表Ｓ２）。
2.
GCPの免疫蛍光定量。 横の軸線、FIの比率（成長の円錐形/遠位軸索）、縦方向の軸線、区域の比率（成長の円錐形/遠位軸索）。 横軸はGC蓄積指数を示しています（1.0の比率;縦の黒い点線は、所与のタンパク質が遠位軸索対成長円錐に均等に分布していることを示しています）。 GAP-43(Gap43;1.315)のFI比は青色の点線で示しています。 グラフの右上の領域のタンパク質は、軸索よりも成長円錐に集中しています。 これらの多くはアクチン結合タンパク質および小胞輸送に関与するタンパク質である。 各タンパク質のFI比は、比較点としてGAP-43を用いたKruskal-Willis統計試験（46）を用いて試験した。 タンパク質は、両側の９ ５％信頼区間に基づいてグループ化された、すなわち、ＧＡＰ−４ ３（それぞれ、赤、青、および黒で示される）のそれよりも高いか、類似しているか、ま なお、予想通り、成長円錐に集中しているf-アクチン（rhodamine phalloidinで検出されたように、赤色）と、成長円錐よりも軸索の高いレベルにあるβ-チューブリン（緑色）は、グラフ上で互いに離れていることに注意してください。 詳細については、表S4を参照してください。
タンパク質は遠位軸索よりも成長円錐に集中している。
我々は次に、我々の研究で同定されたタンパク質が成長円錐に特異的または局所的に特異的である程度を決定することを試みた。 これを行うために、我々は遠位軸索におけるそれらの分布と成長円錐におけるタンパク質の分布を比較した。 この方法が定量的である程度まで、本発明者らは、成長錐体中のタンパク質の相対濃度と遠位軸索とを比較することもできた（図１ ０Ａ）。 および表Ｓ４）。 本発明者らは、成長円錐蓄積指数を、遠位軸索における蛍光強度（Ｆ ｉ）と比較した成長円錐における蛍光強度（Ｆ ｉ）の比として定義した（図１）。 図2、表S4、SIテキスト、および図。 S1）。 また、各タンパク質の分布パターンを調べるために、別の指標、すなわち面積比を使用した（図。 S2）。 成長の円錐形の蓄積の索引は成長の円錐形の蛋白質の蓄積の相対的なレベルの徴候です。 GAP-43と比較して検査されたタンパク質の厳密な分類を容易にする我々の結果に統計的ウィルコキソンランクサムテストを適用することにより、この これらのタンパク質は、現在確立されている成長円錐マーカータンパク質GAP-43（7）よりも成長円錐ではるかに高いレベルにあるように見える（Fig. 図2、赤で示す）。 また、33個のタンパク質については、統計誤差領域がGAP-43のそれと重複することがわかったため、このタンパク質のセットをGAP-43と同様の程度に成長円錐に集中していると分類した（図。 図2、青で示す）。
RNAi分析は、軸索の長さと成長円錐の機能マーカーとの関連性を明らかにする。
我々は、軸索成長におけるマーカータンパク質候補の役割をテストするためにRNAiベースのアプローチを使用しました。 軸索の長さを測定することにより、活性誘導軸索成長を評価した（SIテキストを参照；ノックダウンおよび特異性の確認については、図10Aも参照）。 S1）。 本発明者らは、RNAi処置のために68個の遺伝子を選択し、それらの17個の破壊が、厳格なノンパラメトリック試験、すなわちKruskal-Willis試験の適用によって、軸索長 図３Ａ、表１、および表Ｓ８）。 我々は、推定機能的成長円錐マーカーとして17のタンパク質を分類する（表1）。 定量的免疫染色の結果を考慮すると（図。 図2)に示すように、これらのタンパク質は、GAP-43よりも濃縮されたタンパク質に分類することができる（図中の赤で示すタンパク質。 ＧＡＰ−４ ３（図２では青色で示すタンパク質）またはｇａｐ−４ ３（図２では青色で示すタンパク質）と同様である。 2). これらの17のタンパク質のうち、五つの細胞骨格タンパク質（Tmod2、Cap1、Cotl1、CapZb、およびSept2）、四つの膜輸送タンパク質（Pacs1、Stx7、Snap25A、およびRtn1）、二つのGTP結合タンパク質（Gnai2、Gnao1）、小さなGタンパク質シグナル伝達に関与する二つのタンパク質（Farp2およびCyfip1）、三つのシグナリングアダプタタンパク質（Strap、FABP7、およびCrmp1）、および一つの受容体候補（Clptm1）がある。
3.
RNAiによるnGAPsの同定。 (A)軸索の成長に影響を与える遺伝子。 成長円錐活性における同定されたタンパク質の役割は、軸索成長のRNAi誘発性の減少を探してアッセイした。 ＲＮＡｉは、記載のようにして行った（４ ５）。 斜線の左側にある８つのタンパク質は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗｉｌｌｉｓ試験（赤色；図１の赤色でも示される）を用いて統計的に判断されるＧＡＰ−４ ３よりも優れたＦＩ比を有する。 図2)に示すように、斜線の右側の九つのタンパク質は、同じ試験によって判断されるように、GAP-43のFI比と同様のFI比を有する。 ＥＧＦＰ陽性ニューロンの軸索長（ｓｉＲＮＡなし）を対照として使用した（青色；図１ ０に青色でも示されている。）。 2). 全てのｓｉＲＮＡ（ＧＦＰを除く）は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和試験（対照と比較）においてＰ＜５ ４ ７ １＞０． データは平均±ＳＥＭとして示す。 測定されたニューロンの数は、各バーの下部に示されています。 （Ｂ）免疫局在化による候補成長円錐マーカー蛋白質の分類。 本発明者らは、免疫染色画像の定量分析を用いて成長円錐のCおよびPドメインを定義した（上部の図；SIテキストおよび図を参照）。 S2）。 蛋白質を四つのグループに分類した：グループI（ex。 Pacs1),主にP領域に局在(C P);グループII(ex. ＣおよびＰ領域（Ｃ≡Ｐ）の両方で検出されたｓｙｘ７）；グループＩＩＩ（ｅ ｘ． Ｃ領域（Ｃ≡Ｐ）に主に局在化されたｇｎａｉ２）；およびグループＩＶ（ｅ ｘ． Rtn1)は、C領域(C)に特異的に局在する。 それぞれの場合において、左の図は、各グループの典型的なタンパク質分布の要約である。 培養ラット皮質ニューロンにおける抗カンジダテンタンパク質抗体検出の免疫蛍光顕微鏡写真をＡ．マゼンタと緑で示し，それぞれ抗原蛋白質とα-チューブリンビューを示した。 遠いビューには、マージされた画像が表示されます。 ３つの群（群ｉ〜ＩＩＩ）も、図１の凡例に示されている。 S4… Α-チューブリンは主に軸索で検出されるが、成長円錐の中央領域でも検出可能であることに注意してください。 各タンパク質の詳細な特性および省略名については、表1を参照してください。 （スケールバー：10μ m。)
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表1.
図に記載されている候補のほとんどは、図に記載され 3Aは、成長円錐との以前に検出されなかった関連を明らかにし、機能的に関連していた（表1）。 Sept2、Cap1（G-アクチン結合タンパク質）、Snap25A、およびCyfip1は、PC12細胞またはニワトリまたはショウジョウバエニューロン（21-24）の研究に基づいて、成長円錐の行動 二つのGTP結合タンパク質（Gnai2、Gnao1）とレギュレータ（Farp2）については、彼らが軸索の成長（25-27）のために必要または不可欠であるかどうかは知られていないが、阻害剤に成長円錐応答の調節への関与が報告されている。 我々の知る限りでは、他の10のタンパク質のどれも以前に哺乳類細胞や線虫やショウジョウバエなどの無脊椎動物モデル生物の成長円錐調節因子であることが報告されていませんでしたが、そのパラログは神経突起の成長に関連している可能性があります。 我々は簡単に表1にこれらのタンパク質に関する現在の情報を要約します。 我々の研究で同定され、RNAiでテストされた最大3の17タンパク質は、以前に我々は成長円錐機能に関与する追加の分子の効率的な同定に成功したことを示唆し、軸索の成長に関与している。 合計で、RNAi分析の結果は、GAP-43よりも高いまたは同様のFI比を有する17タンパク質を指し、それらを新規神経成長関連タンパク質（NGAP;refs. および３ ０）。
成長円錐は、形態学的および機能的に異なる領域で構成され、中央（C）領域および周辺（P）領域と呼ばれます（31）。 C領域は小胞および微小管に富み、おそらく軸索成長のための膜拡張に関与している。 Ｐ領域はアクチンフィラメントに富み，おそらく原動力を生成する。 C領域のマーカーとしてチューブリンを用いた（図参照）。 S3)では、マーカータンパク質をp領域に主に局在するグループI、両領域に検出されるグループII、C領域に主に局在するグループIII、c領域に特異的に局在するグループIVに分類した(Fig. また、図３Ｂを参照されたい。 Ｓ３およびＳ４）。
私たちが観察した局在のパターンは、予測されていたものとは多少異なっていました。 例えば、Pacs1はオルガネラ選別に関与することが報告されているが、軸索では、Pacs1はF-アクチンが濃縮されているP領域に局在する（図10a）。 3B）。 推定可溶性アダプタータンパク質、Tgf-βシグナル伝達（32）の下流として報告されているストラップ、およびClptm1、未知の膜貫通タンパク質（33）は、また、P領域に 対照的に、sept2は、PC12細胞のPドメインで発見されたことが以前に報告されていたにもかかわらず、チューブリン陽性領域の近くで検出される（21）。 唯一のRtn1、ERタンパク質と推定膜人身売買レギュレータ（34）は、具体的には、C領域マーカーとして潜在的に有用なこと、C領域に局在していた。
