Genetyczne podstawy adaptacyjnego melanizmu u myszy kieszonkowych

wyniki i dyskusja

myszy zebrano z sześciu miejsc w czterech regionach geograficznych, w tym zarówno jasnych, jak i ciemnych substratów (Fig. 1a). We wszystkich przypadkach zaobserwowaliśmy ścisłe dopasowanie koloru podłoża do koloru pelagi grzbietowej (rys. 1B). Myszy z Doliny Portal i Avra były jednolicie lekkie. Spośród myszy 29 z miejsca Pinakatu, myszy 16 z myszy 18 (89%) złapanych na ciemnej lawie były ciemne, podczas gdy myszy 10 z myszy 11 (91%) złapanych na jasnych skałach były lekkie (Fig. 1B). Podobnie, spośród myszy 20 z Armendaris, 7 myszy 8 (88%) złapanych na ciemnej lawie było ciemnych, podczas gdy wszystkie myszy 12 (100%) złapane na jasnych skałach były lekkie. W tych populacjach fenotypowa zmienność koloru była w dużej mierze dyskretna, a nie ilościowa; wszystkie myszy można było łatwo zaklasyfikować jako lekkie lub melaniczne na podstawie obecności lub braku podterminalnego pasma feomelaniny na pojedynczych włosach na grzbiecie.

w zasadzie możliwe jest kilka podejść do identyfikacji genów leżących u podstaw interesującego fenotypu. Jednakże C. intermedius są trudne do rozmnażania w niewoli, dlatego każde podejście polegające na krzyżowaniu nie jest praktyczne. Zamiast tego wykorzystaliśmy badania asocjacyjne z genami kandydującymi do identyfikacji mutacji odpowiedzialnych za obserwowane różnice fenotypowe. Około 1,5 kb intronicznego DNA z locus agouti zsekwencjonowano u 36 myszy, w tym przedstawicieli ze wszystkich miejsc. Mutacja czarno-brązowa u myszy laboratoryjnej wytwarza ciemną grzbietową część z niepozornymi włoskami i jest spowodowana przez wstawienie zakłócające promotor grzbietowy, ≈15 kb 5′ kodonu startowego (15). Wnioskowaliśmy, że podobną mutację w C. intermedius można wykryć poprzez powiązanie z polimorfizmami w neutralnych miejscach na umiarkowanych odległościach genomu (0-50 kb, w zależności od wieku mutacji). Zaobserwowaliśmy 16 polimorfizmów pojedynczych nukleotydów i 5 polimorfizmów insercji / delecji, w tym kilka z częstotliwością pośrednią; żaden nie wykazał związku z kolorem powłoki. Istnieją dwa możliwe wyjaśnienia tego braku związku: Albo agouti nie jest głównym wyznacznikiem obserwowanych różnic fenotypowych, albo agouti jest zaangażowany, ale istnieje niewielki lub żaden brak równowagi między badanymi przez nas miejscami a miejscami czynnościowymi.

oba allele całego genu Mc1r (954 bp) zsekwencjonowano u 69 myszy na Fig. 1. Zaobserwowano dwadzieścia cztery polimorfizmy jednonukleotydowe: 15 było synonimicznych, a 9 niesynonimicznych. Cztery z dziewięciu polimorfizmów aminokwasowych zaobserwowano tylko u ciemnych myszy z miejsca Pinakatu (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp i Gln-233 → His). Te cztery warianty aminokwasów były obecne z dużą częstotliwością (82%) wśród ciemnych myszy Pinakatowych i znajdowały się w całkowitym braku równowagi między sobą. Wszystkie inne polimorfizmy aminokwasowe Mc1r były obecne w niskich częstotliwościach i nie wykazywały związku z kolorem myszy. Rozkład zmienności nukleotydów Mc1r wśród myszy lekkich i melanicznych z miejsca Pinakatu przedstawiono w tabeli 1.

kilka obserwacji sugeruje, że jedna lub więcej z tych czterech mutacji aminokwasowych (miejsca 18, 109, 160 i 233) jest odpowiedzialnych za jasne/ciemne różnice fenotypowe obserwowane w populacji Pinakatów. Po pierwsze, istnieje doskonały związek między genotypem i fenotypem(Tabela 2). W pojedynczej populacji panmiktycznej bez kojarzenia asortymentowego związek między zmiennością genotypową i fenotypową jest nieoczekiwany, chyba że gen lub ściśle powiązany gen jest odpowiedzialny za fenotyp. Jednak struktura populacji może wytworzyć fałszywy związek nawet wtedy, gdy gen nie jest zaangażowany w różnice fenotypowe (19). Przetestowaliśmy tę hipotezę poprzez sekwencjonowanie mitochondrialnych genów COIII i ND3 u wszystkich myszy z okolicy Pinakatu (n = 29). Filogeneza tych mitochondrialnych genów pokazuje, że haplotypy jasnych i ciemnych myszy są ze sobą powiązane, nie dostarczając dowodów na ukrytą strukturę populacji (Fig. 2). Ponieważ większość przepływu genów w Chaetodipus jest prawdopodobnie mediowana przez mężczyzn (20) i ponieważ Genom mitochondrialny ma efektywną wielkość populacji o jedną czwartą efektywnej wielkości autosomów, mitochondrialne DNA zapewnia wrażliwy marker do wykrywania struktury populacji. Te dane mtDNA dostarczają również dalszych dowodów na selekcję w zakresie ciemnych / jasnych różnic fenotypowych. W populacji Pinakatów częstość występowania ciemnych myszy na jasnym podłożu (9%) i częstość występowania ciemnych myszy na ciemnym podłożu (89%) można wykorzystać do oszacowania stopnia zróżnicowania populacji pod kątem różnic fenotypowych między tymi dwoma sąsiadującymi obszarami . Wartość ta jest >10 razy większa niż odpowiadająca jej wartość dla mtDNA, co jest zgodne z ideą, że wybór napędza różnice fenotypowe. Przyszłe badania oparte na większych próbkach wykorzystujących to podejście pozwolą nam oszacować wielkość selekcji z modeli równowagi migracja-selekcja.

po drugie, wszystkie cztery niesynonimiczne podstawienia, które wykazują związek z kolorem sierści, powodują zmianę ładunku aminokwasowego. W pierwszych trzech miejscach aminokwasowych (18, 109, 160) zmiana następuje z dodatnio naładowanej argininy do niezaładowanego aminokwasu. W czwartym miejscu (233) nienaładowaną glutaminę zastępuje się dodatnio naładowaną histydyną. Dodatkowo, wszystkie cztery mutacje znajdują się w funkcjonalnie ważnych regionach receptora, które mogą być zaangażowane w interakcje z innymi białkami. Dwie z podstawień znajdują się w regionach zewnątrzkomórkowych (miejsca aminokwasowe 18 i 109), a dwie w regionach wewnątrzkomórkowych (miejsca 160 i 233).; żadne z nich nie znajdują się w domenach transbłonowych receptora (rys. 3). Wiele wcześniej opisanych ciemnych fenotypów w locus rozszerzenia u myszy (16) i innych organizmów (21-25) wynika z mutacji pojedynczych aminokwasów w MC1R, chociaż żadna z opisanych tutaj mutacji nie została wcześniej zgłoszona. U myszy laboratoryjnej, allele tytoniowe (Etob) i ponure (Eso) ciemniejące są spowodowane mutacjami odpowiednio w pierwszej domenie wewnątrzkomórkowej i pierwszej domenie zewnątrzkomórkowej. Etob koduje receptor melanokortyny-1, który pozostaje wrażliwy na hormon stymulujący α-melanocyty, ale jest nadpobudliwy, podczas gdy Eso koduje konstytutywnie aktywny receptor (16). Podobnie jak allel Etob u Mus, melaniczny C. intermedius ma ciemny kolor ograniczony do grzbietu.

Po Trzecie, ciemny allel dominuje nad jasnym allelem, zgodnie z obserwacjami mutacji Mc1r u myszy (11, 16) i innych organizmów (21-25). U myszy laboratoryjnej mutacje utraty funkcji w Mc1r są recesywne i powodują jasną barwę, podczas gdy allele wzmocnienia funkcji są dominujące i powodują ciemną barwę (16). Wszystkie heterozygotyczne myszy obserwowane w miejscu Pinakatu są ciemne z niepozornymi włoskami i są fenotypowo podobne do homozygotycznych ciemnych myszy.

wreszcie, wzór zmienności nukleotydów obserwowany wśród alleli Mc1r z miejsca Pinakatu sugeruje ostatnie działanie pozytywnej selekcji. Trzynaście polimorficznych miejsc jest zmiennych wśród jasnych haplotypów, podczas gdy tylko jedno miejsce jest zmienne wśród ciemnych haplotypów (Tabela 1). Stosunek wariantu do miejsc niezmiennych jest znacząco różny między ciemnymi i jasnymi allelami (1/953 i 13/941, dokładny test Fishera, P < 0,01). Średni poziom różnorodności nukleotydów wśród alleli lekkich (π = 0.21%) jest >10 razy większa niż różnorodność nukleotydów wśród ciemnych alleli (π = 0,01%). Zmniejszona zmienność obserwowana wśród ciemnych alleli Mc1r jest oczekiwanym wzorem, jeśli selekcja ustaliła ostatnio substytucję adaptacyjną (26-28). Pojedyncze miejsce nieme (nukleotyd 633) jest w pełni połączone z substytucjami aminokwasowymi obecnymi u wszystkich ciemnych zwierząt; wzór ten jest zgodny z genetycznym opisem tego miejsca niemego na wybranym haplotypie. Jednak dwa standardowe testy neutralności (29, 30) nie wykrywają selekcji na Mc1r w populacji Pinakatu, ani w próbie całkowitej, ani w subpopulacjach na jasnym lub ciemnym podłożu. Test McDonalda-Kreitmana (29) porównuje stosunek synonimicznych do niesynonimicznych zmian w obrębie i między gatunkami; tutaj stosunek ten zmienia się tylko nieznacznie przez cztery podstawienia aminokwasów, które odróżniają jasne i ciemne allele Mc1r. Test HKA (30) porównuje różnice w obrębie i między gatunkami dla dwóch różnych genów (w tym przypadku Mc1r i mtDNA); jednak poziom zmienności nukleotydów w Mc1r nie jest znacząco zmniejszony nawet w subpopulacji na ciemnym podłożu, ze względu na obecność heterozygotów Mc1r.

z powodu całkowitego braku równowagi między witrynami aminokwasowymi 18, 109, 160 i 233 (Tabela 1), nasze dane nie pozwalają nam określić względnego udziału każdego z tych witryn w obserwowanych różnicach w Kolorze, ani nie wykluczają możliwości, że powiązany gen jest odpowiedzialny za obserwowane różnice fenotypowe. Ta ostatnia możliwość wydaje się mało prawdopodobna z powodów opisanych powyżej, a także dlatego, że żadne geny pigmentacyjne nie są ściśle związane z Mc1r u ludzi lub Mus. U myszy laboratoryjnej zmiany pojedynczych aminokwasów w Mc1r są wystarczające do wytworzenia ciemnego koloru (16). Badania funkcjonalne z wykorzystaniem konstruktów Mc1r w systemie ekspresji in vitro mogą być wykorzystane do pomiaru względnego wpływu czterech mutacji na aktywację receptora. Wstępne wyniki testów cAMP wskazują, że ciemny allel koduje nadpobudliwy receptor w stosunku do jasnego allelu, zapewniając silne wsparcie dla roli Mc1r w obserwowanych różnicach fenotypowych (H. E. H., H. Fujino, J. Regan i M. W. N., niepublikowane dane). Stosując to podejście do konstruktów, które zawierają każdą z czterech mutacji indywidualnie i łącznie, mamy nadzieję rozróżnić dwa różne modele Mc1r evolution: (i) za zaobserwowane różnice fenotypowe odpowiada pojedyncza różnica aminokwasowa, a pozostałe warianty aminokwasowe występują w wybranym miejscu, lub (ii) do wytworzenia zaobserwowanych różnic fenotypowych wymagane są dwa lub więcej wariantów aminokwasowych (działających addytywnie lub epistatycznie).

co zaskakujące, przedstawione tutaj dane implikują zmiany aminokwasów w Mc1r w ciemnym fenotypie w populacji Pinakatów, ale nie w populacji Armendarisa. Wśród 40 alleli Armendarisa zaobserwowano tylko jeden polimorfizm aminokwasowy Mc1r (Ala-285 → Thr); ten wariant był obecny w 2 z 24 alleli u jasnych myszy i 0 z 16 alleli u ciemnych myszy. Dwa nieme polimorfizmy występowały z częstotliwością pośrednią (48%) wśród 40 alleli Armendaris, ale żaden z nich nie wykazywał żadnego związku z mysim kolorem. W rzeczywistości częstość występowania tych polimorfizmów była bardzo podobna u myszy ciemnych (50%) i jasnych (45%). Brak związku między polimorfizmami nukleotydowymi w regionie kodującym Mc1r a kolorem myszy U Armendarisa sprawia również, że mało prawdopodobne jest, aby niezrównoważone miejsca w regionie promotora były odpowiedzialne za różnice fenotypowe, chyba że nierównowaga połączenia rozpada się bardzo szybko. Region promotora Mc1r został dobrze scharakteryzowany zarówno u myszy (31), jak i u ludzi (32) i leży ≈500 bp przed kodonem startowym. Ogólnie rzecz biorąc, wzorce zmian nukleotydów w regionie kodującym Mc1r w próbkach z Armendaris (zarówno jasnych, jak i ciemnych), Portal i doliny Avra były nieujawnione. Poziomy różnorodności nukleotydów wahały się od 0,11% do 0,19%, podobnie jak wartość obserwowana dla zwierząt lekkich z miejsca Pinakatu.

fakt, że cztery mutacje obserwowane u Melanicznych myszy Pinakatowych (Arg-18 → Cys, Arg-109 → Trp, Arg-160 → Trp i Gln-233 → His) są nieobecne u melanicznych myszy z Armendaris wskazuje, że podobny ciemny fenotyp wyewoluował niezależnie od tych różnych przepływów lawy i dokonał tego poprzez różne zmiany genetyczne, chociaż geny zaangażowane w populację Armendaris nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Odrębna molekularna podstawa tego samego fenotypu w dwóch różnych populacjach dostarcza mocnych dowodów na zbieżną ewolucję fenotypową w stosunkowo krótkim czasie; oba strumienie lawy mają mniej niż milion lat.

podczas gdy mutacje MC1R ciemniejące zostały zidentyfikowane u innych gatunków (16, 21-25), kontekst ekologiczny dla zmian nie jest rozumiany (24, 25) lub jest spowodowany Sztuczną selekcją (22, 23). Sowy są ważnymi drapieżnikami myszy kieszonkowych (8, 9) i są znane z rozróżniania jasnych i ciemnych myszy na jasnym i ciemnym podłożu, nawet podczas żerowania w nocy przy słabym natężeniu światła (10). Tak więc jest prawdopodobne, że sowy odgrywają ważną rolę w wyborze do ukrywania zabarwienia. Przedstawione tutaj dane przedstawiają rzadki przykład zmian molekularnych leżących u podstaw adaptacji w prostym i naturalnym środowisku ekologicznym.