Identyfikacja funkcjonalnych białek markerowych w stożku wzrostu ssaków

weryfikacja lokalizacji stożka wzrostu sugeruje znikomy wskaźnik fałszywie dodatni.

następnie chcieliśmy określić specyficzność naszego podejścia do proteomiki, tj. określić wskaźnik fałszywie dodatni. Ogólnie rzecz biorąc, należy porównać daną frakcję z inną frakcją biochemiczną. Jednakże nie można wytworzyć żadnych frakcji z rozwijającego się mózgu o porównywalnej czystości do frakcji GCP lub GCM. Tak więc, aby ułatwić Generowanie zestawu danych porównawczych, przeprowadziliśmy systematyczną immunodetekcję podzbioru białek w hodowanych neuronach korowych (patrz tabela S4, tabela S5, tabela S6 i tabela S7). Wykluczyliśmy wszechobecne lub powszechnie wyrażane białka, takie jak enzymy metaboliczne i molekularne białka opiekuńcze, abyśmy mogli skupić się na białkach, które mogą być szczególnie istotne dla funkcji specyficznych dla stożka wzrostu. W sumie przyjrzeliśmy się rozkładom 131 białek (tj. ≈15% zidentyfikowanych białek). Dane potwierdzają, że w hodowanych neuronach korowych szczura wszystkie badane przez nas białka są wykrywalne w obszarze stożka wzrostu (Fig. 2 I Tabela S4). Rzeczywiście, żadne badane przez nas białka nie mogły zostać wykryte w innych regionach aksonalnych, ale nie w stożku wzrostu, co sugeruje bardzo niski wskaźnik fałszywie dodatni i potwierdza nasze ogólne podejście. Ponadto nasze dane proteomiczne w GCP lub GCM nie zawierały czynników transkrypcyjnych, co sugeruje, że zanieczyszczenie składnikami jądrowymi jest również znikome (Fig. 1D, tabela S1 i tabela S2).

białka bardziej skoncentrowane w stożku wzrostu niż w Aksonie dystalnym.

następnie staraliśmy się określić stopień, w jakim białka zidentyfikowane w naszym badaniu są specyficzne lub lokalnie specyficzne dla stożka wzrostu. Aby to zrobić, porównaliśmy dystrybucję białek w stożkach wzrostu z ich dystrybucją w dystalnych aksonach. W zakresie, w jakim metoda ta jest ilościowa, byliśmy również w stanie porównać względne stężenia białek w stożkach wzrostu w porównaniu do aksonów dystalnych (Fig. 2 I Tabela S4). Zdefiniowaliśmy wskaźnik akumulacji stożka wzrostu jako stosunek intensywności fluorescencji (FI)w stożku wzrostu w porównaniu z aksonem dystalnym (Fig. 2, Tabela S4, tekst SI i Rys. S1). Użyliśmy również innego indeksu, tj. stosunku powierzchni, aby zbadać wzorce dystrybucji każdego białka (rys. S2). Wskaźnik akumulacji stożka wzrostu jest wskaźnikiem względnego poziomu akumulacji białka w stożku wzrostu. Stosując statystyczny Test Wilcoxona rank-sum do naszych wyników, ułatwiając ścisłą klasyfikację badanych białek w porównaniu z GAP-43, nasza kwantyfikacja systematycznego podejścia do immunostainingowania przy użyciu tego wskaźnika wykazała, że aż 69 białek zidentyfikowanych przez proteomikę wykryto na wyższych poziomach w obszarze stożka wzrostu niż w aksonie dystalnym. Białka te wydają się być na znacznie wyższych poziomach w stożkach wzrostu niż obecnie ustalona szczelina białka markera stożka wzrostu-43 (7) (Fig. 2, pokazane na Czerwono). Odkryliśmy również, że dla 33 białek obszary błędu statystycznego pokrywają się z obszarem GAP-43, dlatego kategoryzujemy ten zestaw białek jako skoncentrowany w stożku wzrostu w podobnym stopniu, jak to jest GAP-43 (Fig. 2, pokazane na niebiesko).

Analiza RNAi ujawnia znaczenie długości aksonu i funkcjonalnych markerów stożka wzrostu.

zastosowaliśmy podejście oparte na RNAi do testowania roli kandydatów na białka markerowe w rozwoju aksonów. Wzrost aksonalny wywołujący aktywność oceniano mierząc długość aksonalną (patrz tekst SI; potwierdzenie knockdown i swoistość, patrz również Fig. S1). Wybraliśmy 68 genów do leczenia RNAi i odkryliśmy, że zaburzenie 17 z nich doprowadziło do krótszej długości aksonalnej, poprzez zastosowanie rygorystycznego testu nieparametrycznego, tj. testu Kruskala-Willisa (Fig. 3A, Tabela 1 i tabela S8). Kategoryzujemy 17 białek jako przypuszczalne funkcjonalne markery wzrostu (Tabela 1). Biorąc pod uwagę wyniki ilościowe immunostaining (rys. 2), białka te można podzielić na białka bardziej skoncentrowane niż GAP-43 (białka pokazane na czerwono na Fig. 2) lub podobne do GAP-43 (białka pokazane na niebiesko na Fig. 2). Spośród tych 17 białek, istnieje pięć białek cytoszkieletowych (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb i Sept 2), cztery białka handlujące błonami (Pacs1, Stx7, Snap25a i Rtn1), dwa białka wiążące GTP (Gnai2, Gnao1), dwa białka zaangażowane w sygnalizację małego białka G (Farp2 i Cyfip1), trzy białka adaptera sygnalizacji (Strap, FABP7 i Crmp1) i jeden kandydat na receptor (Clptm1).

większość kandydatów wymienionych na Rys. 3A ujawniło wcześniej niewykryte skojarzenia ze stożkami wzrostu i były powiązane funkcjonalnie (Tabela 1). Sept2, Cap1 (białko wiążące G-aktynę), Snap25a i Cyfip1 zostały zasugerowane do odgrywania ról w zachowaniu stożka wzrostu, na podstawie badań na komórkach PC12 lub neuronach kurcząt lub Drosophila (21-24), ale ich dokładne role w stożku wzrostu ssaków nie są znane. W przypadku dwóch białek wiążących GTP (Gnai2, Gnao1) i regulatora (Farp2) odnotowano udział w regulacji odpowiedzi stożka wzrostu na inhibitory, chociaż nie wiadomo, czy są one konieczne lub niezbędne do wzrostu aksonów (25-27). Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, żadne z pozostałych 10 białek nie było wcześniej zgłaszane jako regulatory stożka wzrostu w komórkach ssaków lub modelowych organizmach bezkręgowców, takich jak C. elegans lub Drosophila, chociaż ich paralogi mogą być związane ze wzrostem neurytu . Krótko podsumowujemy aktualne informacje na temat tych białek w tabeli 1. Co najwyżej 3 z 17 białek zidentyfikowanych w naszym badaniu i przetestowanych za pomocą RNAi były wcześniej zaangażowane w wzrost aksonów, co sugeruje, że udało nam się skutecznie zidentyfikować dodatkowe cząsteczki zaangażowane w funkcje stożka wzrostu. W sumie wyniki analizy RNAi wskazują na 17 białek o wyższym lub podobnym stosunku FI niż GAP-43, co czyni je silnymi kandydatami do nowych białek związanych ze wzrostem neuronów (nGAPs; refs. 4 i 30).

stożek wzrostu składa się z morfologicznie i funkcjonalnie odrębnych regionów określanych jako regiony Centralne (C) i peryferyjne (P) (31). Region C jest wzbogacony w pęcherzyki i mikrotubule i prawdopodobnie bierze udział w ekspansji błony dla wzrostu aksonów. Region P jest wzbogacony w włókna aktyny i prawdopodobnie generuje siłę napędową. Stosowanie tubuliny jako markera dla regionu C (patrz ryc. S3), sklasyfikowaliśmy białka markerowe na cztery grupy: grupę I, zlokalizowaną głównie w regionie P; grupę II, wykrytą w obu regionach; grupę III, zlokalizowaną głównie w regionie C; i grupę IV, specyficznie zlokalizowaną w regionie C (Fig. 3B; patrz także: figi. S3 i S4).

wzorce lokalizacji, które obserwowaliśmy, były nieco inne od tego, co można było przewidzieć. Na przykład, Pacs1 został zgłoszony do udziału w sortowaniu organelli, ale w aksonach, Pacs1 lokalizuje się do regionu P, Gdzie f-aktyna jest wzbogacona (Fig. 3b). Przypuszczalne rozpuszczalne białko adaptera, taśma, która została zgłoszona jako następująca po sygnale TGF-β (32) i clptm1, nieznane białko transbłonowe (33), są również zlokalizowane w regionie P. W przeciwieństwie do tego, Sept 2 jest wykrywany w pobliżu regionu tubulin-dodatniego, pomimo faktu, że wcześniej stwierdzono, że znajduje się w domenie P w komórkach PC12 (21). Tylko Rtn1, białko ER i przypuszczalny regulator handlu błoną (34), został specjalnie zlokalizowany w regionie C, co czyni go potencjalnie użytecznym jako marker regionu C.