Baza genetică a melanismului adaptiv la șoarecii de buzunar

rezultate și discuții

șoarecii au fost colectați din șase situri din patru regiuni geografice, incluzând atât substraturi ușoare, cât și întunecate (Fig. 1A). În toate cazurile, am observat o potrivire strânsă între culoarea substratului și culoarea pelajului dorsal (Fig. 1B). Șoarecii din Portal și Valea Avra au fost uniform ușori. Dintre cei 29 de șoareci din situl Pinacate, 16 din 18 șoareci (89%) prinși pe lava întunecată au fost întunecați, în timp ce 10 din 11 șoareci (91%) prinși pe rocile de culoare deschisă au fost ușori (Fig. 1B). În mod similar, din cei 20 de șoareci de la Armendaris, 7 din 8 șoareci (88%) prinși pe lava întunecată erau întunecați, în timp ce toți cei 12 șoareci (100%) prinși pe rocile de culoare deschisă erau ușori. În aceste populații, variația fenotipică a culorii a fost în mare parte discretă, mai degrabă decât cantitativă; toți șoarecii au fost ușor clasificați ca lumină sau melanică pe baza prezenței sau absenței unei benzi subterane de feomelanină pe firele individuale de păr de pe dorsum.

în principiu, sunt posibile mai multe abordări pentru identificarea genelor care stau la baza unui fenotip de interes. Cu Toate Acestea, C. intermediarii sunt greu de reprodus în captivitate și, prin urmare, orice abordare care se bazează pe cruci nu este practică. În schimb, am folosit studii de asociere cu gene candidate pentru a identifica mutațiile responsabile pentru diferențele fenotipice observate. Aproximativ 1, 5 kb de ADN intronic din locusul agouti au fost secvențiate la 36 de șoareci, inclusiv reprezentanți din toate siturile. Mutația neagră și bronzată la șoarecele de laborator produce un dorsum întunecat cu fire de păr neîmbrăcate și este cauzată de o inserție care perturbă promotorul dorsal, 15 kb 5′ din codonul de pornire (15). Am argumentat că o mutație similară în C. intermedius ar putea fi detectată prin legătura cu polimorfismele la site-uri neutre pe distanțe genomice moderate (0-50 kb, în funcție de vârsta mutației). Am observat 16 polimorfisme mononucleotidice și 5 polimorfisme de inserție / deleție, inclusiv mai multe la frecvențe intermediare; niciuna nu a prezentat o asociere cu culoarea stratului. Există două explicații posibile pentru această lipsă de asociere: Fie agouti nu este un determinant principal al diferențelor fenotipice observate, fie agouti este implicat, dar există un dezechilibru de legătură redus sau deloc între siturile pe care le-am examinat și situl(siturile) funcțional (e).

ambele alele ale întregii gene Mc1r (954 bp) au fost secvențiate la cei 69 de șoareci din Fig. 1. Au fost observate douăzeci și patru de polimorfisme cu un singur nucleotid: 15 au fost sinonime și 9 nonsinonime. Patru din cele nouă polimorfisme de aminoacizi s-au observat doar la șoarecii întunecați din localitatea Pinacate (ARG-18 CTX, ARG-109 CTX, ARG-160 CTX și Gln-233 CTX). Aceste patru variante de aminoacizi au fost prezente la frecvență înaltă (82%) în rândul șoarecilor întunecați Pinacate și au fost în dezechilibru complet de legătură unul cu celălalt. Toate celelalte polimorfisme ale aminoacizilor Mc1r au fost prezente la frecvențe joase și nu au arătat nicio asociere cu culoarea mouse-ului. Distribuția variației nucleotidelor Mc1r în rândul șoarecilor ușori și melanici din situsul Pinacat este prezentată în tabelul 1.

mai multe observații sugerează că una sau mai multe dintre aceste patru mutații ale aminoacizilor (locurile 18, 109, 160 și 233) sunt responsabile pentru diferențele fenotipice lumină/întuneric observate în populația de Pinacat. În primul rând, există o asociere perfectă între genotip și fenotip (Tabelul 2). Într-o singură populație panmictică fără împerechere asortativă, o asociere între variația genotipică și fenotipică este neașteptată, cu excepția cazului în care gena sau o genă strâns legată este responsabilă pentru fenotip. Cu toate acestea, structura populației poate produce o asociere falsă chiar și atunci când o genă nu este implicată în diferențele fenotipice (19). Am testat această ipoteză prin secvențierea genelor coiii mitocondriale și ND3 la toți șoarecii din localitatea Pinacate (n = 29). O filogenie a acestor gene mitocondriale arată că haplotipurile de la șoareci ușori și întunecați sunt amestecate, oferind nicio dovadă pentru structura ascunsă a populației (Fig. 2). Deoarece majoritatea fluxului de gene din Chaetodip este probabil mediat de bărbați (20) și deoarece genomul mitocondrial are o dimensiune efectivă a populației cu un sfert din dimensiunea efectivă a autozomilor, ADN-ul mitocondrial oferă un marker sensibil pentru detectarea structurii populației. Aceste date ADNmt oferă, de asemenea, dovezi suplimentare de selecție a diferențelor fenotipice întunecate/luminoase. În populația Pinacate, frecvența șoarecilor întunecați pe substrat ușor (9%) și frecvența șoarecilor întunecați pe substrat întunecat (89%) pot fi utilizate pentru a estima gradul de diferențiere a populației pentru diferențele fenotipice dintre aceste două zone adiacente . Această valoare este > de 10 ori mai mare decât valoarea corespunzătoare pentru ADNmt , în concordanță cu ideea că selecția determină diferențele fenotipice. Studiile viitoare bazate pe eșantioane mai mari folosind această abordare ne vor permite să estimăm amploarea selecției din modelele de echilibru migrație–selecție.

în al doilea rând, toate cele patru substituții nonsinonime care arată o asociere cu culoarea stratului provoacă o schimbare a încărcării aminoacizilor. La primele trei site-uri de aminoacizi (18, 109, 160), schimbarea este de la o arginină încărcată pozitiv la un aminoacid neîncărcat. La al patrulea loc (233), o glutamină neîncărcată este înlocuită cu o histidină încărcată pozitiv. În plus, toate cele patru mutații sunt localizate în regiuni importante din punct de vedere funcțional ale receptorului care sunt susceptibile de a fi implicate în interacțiunile cu alte proteine. Două dintre substituții sunt situate în regiuni extracelulare (situri de aminoacizi 18 și 109) și două sunt situate în regiuni intracelulare (situri 160 și 233); niciunul nu este localizat în domeniile transmembranare ale receptorului (Fig. 3). Un număr de fenotipuri întunecate descrise anterior la locusul de extensie la șoarece (16) și alte organisme (21-25) se datorează mutațiilor unice de aminoacizi din MC1R, deși niciuna dintre mutațiile descrise aici nu a fost raportată anterior. La șoarecele de laborator, tutunul (Etob) și alelele întunecate (Eso) sunt cauzate de mutații în primele domenii intracelulare și, respectiv, în primele domenii extracelulare. Etob codifică un receptor de melanocortină-1 care rămâne receptiv la hormonul stimulator al melanocitelor, dar este hiperactiv, în timp ce Eso codifică un receptor activ constitutiv (16). La fel ca alela Etob din Mus, melanic C. intermedius raportat aici au culoare închisă limitată la dorsum.

în al treilea rând, alela întunecată este dominantă asupra alelei ușoare, în concordanță cu observațiile mutațiilor Mc1r la șoarece (11, 16) și alte organisme (21-25). La șoarecele de laborator, mutațiile de pierdere a funcției la Mc1r sunt recesive și au ca rezultat culoarea luminii, în timp ce alelele de câștig de funcție sunt dominante și au ca rezultat culoarea închisă (16). Toți șoarecii heterozigoți observați la locul Pinacatului sunt întunecați cu fire de păr fără bandă și sunt asemănători fenotipic cu șoarecii întunecați homozigoți.

în cele din urmă, modelul de variație a nucleotidelor observat între alelele Mc1r din situl Pinacat sugerează acțiunea recentă a selecției pozitive. Treisprezece situri polimorfe sunt variabile printre haplotipurile ușoare, în timp ce un singur sit este variabil printre haplotipurile întunecate (Tabelul 1). Raportul dintre variantă și site-uri invariante este semnificativ diferit între alelele întunecate și luminoase (1/953 și 13/941, testul exact al lui Fisher, P < 0,01). Nivelul mediu al diversității nucleotidelor în rândul alelelor ușoare (XV = 0.21%) este >de 10 ori mai mare decât diversitatea nucleotidelor în rândul alelelor întunecate (0,01%). Variabilitatea redusă observată în rândul alelelor Mc1r întunecate este modelul așteptat dacă selecția a stabilit recent o substituție adaptivă (26-28). Un singur sit tăcut (nucleotida 633) este în dezechilibru complet de legătură cu substituțiile de aminoacizi prezente la toate animalele întunecate; acest model este în concordanță cu autostopul genetic al acestui sit tăcut pe haplotipul selectat. Cu toate acestea, două teste standard de neutralitate (29, 30) nu reușesc să detecteze selecția pe Mc1r în populația Pinacate, fie în eșantionul total, fie în subpopulațiile pe substrat deschis sau întunecat. Testul McDonald-Kreitman (29) compară raportul dintre modificările sinonime și cele nonsinonime din interiorul și între specii; aici, acest raport este modificat doar ușor de cele patru substituții de aminoacizi care disting alelele Mc1r ușoare și întunecate. Testul HKA (30) compară variația în interiorul și între specii pentru două gene diferite (în acest caz, Mc1r și ADNmt); cu toate acestea, nivelul variabilității nucleotidelor la Mc1r nu este redus semnificativ chiar și în subpopulația pe substrat întunecat, datorită prezenței heterozigoților Mc1r.

din cauza dezechilibrului complet al legăturii dintre situsurile de aminoacizi 18, 109, 160 și 233 (Tabelul 1), datele noastre nu ne permit să determinăm contribuțiile relative ale fiecăruia dintre aceste situsuri la diferențele de culoare observate și nici nu exclud posibilitatea ca o genă legată să fie responsabilă pentru diferențele fenotipice observate. Această din urmă posibilitate pare puțin probabilă din motivele descrise mai sus și, de asemenea, pentru că nici o genă de pigmentare candidată nu este strâns legată de Mc1r nici la om, nici la Mus. La șoarecele de laborator, modificările unice ale aminoacizilor la Mc1r sunt suficiente pentru a produce o culoare închisă (16). Studiile funcționale care utilizează constructe Mc1r într-un sistem de Expresie in vitro pot fi utilizate pentru a măsura efectul relativ al celor patru mutații asupra activării receptorului. Rezultatele preliminare ale testelor cAMP indică faptul că alela întunecată codifică un receptor hiperactiv în raport cu alela ușoară, oferind un sprijin puternic pentru rolul Mc1r în diferențele fenotipice observate (H. E. H., H. Fujino, J. Regan și M. W. N., date nepublicate). Folosind această abordare cu constructe care conțin fiecare dintre cele patru mutații individual și în combinație, sperăm să distingem între două modele diferite pentru evoluția Mc1r: (i) o singură diferență de aminoacizi este responsabilă pentru diferențele fenotipice observate, iar celelalte variante de aminoacizi au făcut autostopul cu situl selectat sau (ii) sunt necesare două sau mai multe variante de aminoacizi (acționând aditiv sau epistatic) pentru a produce diferențele fenotipice observate.

în mod surprinzător, datele prezentate aici implică modificări ale aminoacizilor la Mc1r în fenotipul întunecat din populația Pinacat, dar nu și în populația Armendaris. Doar un singur polimorfism de aminoacizi Mc1r (Ala-285 Thr) a fost observat printre cele 40 de alele de la Armendaris; această variantă a fost prezentă în 2 din 24 de alele la șoareci ușori și 0 din 16 alele la șoareci întunecați. Două polimorfisme silențioase au fost prezente la frecvențe intermediare (48%) printre cele 40 de alele Armendaris, dar niciuna nu a prezentat nicio asociere cu culoarea mouse-ului. De fapt, frecvențele acestor polimorfisme au fost foarte asemănătoare în rândul șoarecilor întunecați (50%) și ușori (45%). Absența unei asocieri între polimorfismele nucleotidice din regiunea de codificare Mc1r și culoarea mouse-ului la Armendaris face, de asemenea, puțin probabil ca siturile nevăzute din regiunea promotorului să fie responsabile pentru diferențele fenotipice, cu excepția cazului în care dezechilibrul legăturii se descompune extrem de rapid. Regiunea promotor a Mc1r a fost bine caracterizată atât la șoareci (31), cât și la oameni (32) și se află la 500 BP în amonte de codonul de pornire. În general, modelele de variație a nucleotidelor în regiunea de codificare a Mc1r în probele din Armendaris (atât lumină, cât și întuneric), Portal și Valea Avra au fost neexcepționale. Nivelurile diversității nucleotidelor au variat de la 0,11% la 0,19%, similar cu valoarea observată pentru animalele ușoare din situl Pinacat.

faptul că cele patru mutații observate la șoarecii de Pinacat melanic (ARG-18 CTX, ARG-109 CTX, ARG-160 CTX și Gln-233 CTX) sunt absente la șoarecii de melanic de la Armendaris indică faptul că un fenotip întunecat similar a evoluat independent pe aceste fluxuri de lavă diferite și a făcut acest lucru prin diferite modificări genetice, deși gena(genele) implicate în populația Armendaris nu au fost încă identificate. Baza moleculară distinctă pentru același fenotip în două populații diferite oferă dovezi puternice pentru evoluția fenotipică convergentă pe un interval de timp relativ scurt; ambele fluxuri de lavă au mai puțin de un milion de ani.

în timp ce mutațiile de întunecare Mc1r au fost identificate la alte specii (16, 21-25), contextul ecologic al modificărilor fie nu este înțeles (24, 25), fie se datorează selecției artificiale (22, 23). Bufnițele sunt prădători importanți ai șoarecilor de buzunar (8, 9) și se știe că discriminează între șoarecii ușori și întunecați pe substraturi ușoare și întunecate chiar și atunci când se hrănesc noaptea sub intensitate scăzută a luminii (10). Astfel, este probabil ca bufnițele să joace un rol important în selectarea pentru ascunderea colorării. Datele raportate aici prezintă un exemplu rar al modificărilor moleculare care stau la baza adaptării într-un cadru ecologic simplu și natural.