Identifiering av funktionella markörproteiner i däggdjurstillväxtkonen

verifiering av Tillväxtkonlokalisering antyder en försumbar falskt positiv hastighet.

vi ville nästa gång bestämma specificiteten för vår proteomics-strategi, dvs att bestämma den falskt positiva hastigheten. I allmänhet bör en jämförelse av en given fraktion göras med en annan biokemisk fraktion. Inga fraktioner från den utvecklande hjärnan kan emellertid framställas med jämförbar renhet med GCP-eller GCM-fraktionerna. För att underlätta generering av en jämförelsedataset utförde vi systematisk immunodetektion av en delmängd av proteinerna i odlade kortikala neuroner (se tabell S4, tabell S5, tabell S6 och tabell S7). Vi utesluter allestädes närvarande eller vanligt uttryckta proteiner som metaboliska enzymer och molekylära chaperoner så att vi istället kunde fokusera på proteiner som kan vara särskilt relevanta för tillväxtkonspecifika funktioner. Totalt tittade vi på fördelningarna av 131 proteiner (dvs 15% av de proteiner vi identifierade). Uppgifterna bekräftar att i odlade råttkortikala neuroner är alla proteiner vi testade detekterbara i tillväxtkonområdet (Fig. 2 och tabell S4). Faktum är att inga proteiner vi testade kunde detekteras i andra axonala regioner men inte i tillväxtkonen, vilket tyder på en mycket låg falsk positiv hastighet och validerar vår övergripande strategi. Dessutom innehöll våra proteomiska data i GCP eller GCM inga transkriptionsfaktorer, vilket tyder på att kontaminering med kärnkomponenter också är försumbar (Fig. 1D, tabell S1 och tabell S2).

proteiner mer koncentrerade i Tillväxtkonen än i den distala axonen.

vi försökte därefter bestämma i vilken utsträckning proteinerna som identifierats i vår studie är specifika eller lokalt specifika för tillväxtkonen. För att göra detta jämförde vi fördelningarna av proteinerna i tillväxtkottar med deras fördelning i distala axoner. I den utsträckning metoden är kvantitativ kunde vi också jämföra de relativa koncentrationerna av proteiner i tillväxtkottar kontra distala axoner (Fig. 2 och tabell S4). Vi definierade tillväxtkonackumuleringsindex som förhållandet mellan fluorescensintensitet (FI) i tillväxtkonen jämfört med det i distal axon (Fig. 2, Tabell S4, SI-Text och Fig. S1). Vi använde också ett annat index, dvs areaförhållandet, för att undersöka fördelningsmönstren för varje protein (Fig. S2). Tillväxtkonackumuleringsindex är en indikation på den relativa nivån av proteinackumulering i tillväxtkonen. Genom att tillämpa det statistiska Wilcoxon rank-sum-testet på våra resultat, vilket underlättar strikt klassificering av de undersökta proteinerna jämfört med GAP-43, visade vår kvantifiering av det systematiska immunfärgning-tillvägagångssättet med hjälp av detta index att så många som 69 proteiner identifierade med proteomik detekterades vid högre nivåer i tillväxtkonområdet än i den distala axonen. Dessa proteiner verkar vara på mycket högre nivåer i tillväxtkottar än det för närvarande etablerade tillväxtkonmarkörproteingapet-43 (7) (Fig. 2, visas i rött). Vi fann också att för 33 proteiner överlappar de statistiska felområdena med GAP-43, Så vi kategoriserar denna uppsättning proteiner som koncentrerade i tillväxtkonen i samma grad som GAP-43 (Fig. 2, visas i blått).

RNAi-analys avslöjar relevans för Axonlängd och funktionella markörer för Tillväxtkonen.

vi använde ett RNAi-baserat tillvägagångssätt för att testa rollerna för markörproteinkandidater i axonal tillväxt. Aktivitetsinducerande axonal tillväxt bedömdes genom mätning av axonal Längd( se SI-Text; för bekräftelse av knockdown och specificitet, se även Fig. S1). Vi valde 68 gener för RNAi-behandling och fann att störning av 17 av dem ledde till kortare axonal längd, genom applicering av ett strikt icke-parametriskt test, dvs Kruskal-Willis-testet (Fig. 3A, Tabell 1 och tabell S8). Vi kategoriserar de 17 proteinerna som förmodade funktionella tillväxtkonmarkörer (Tabell 1). Med tanke på resultaten av den kvantitativa immunfärgning (Fig. 2) kan dessa proteiner klassificeras i proteiner som är mer koncentrerade än GAP-43 (proteiner som visas i rött i Fig. 2) eller liknande GAP-43 (proteiner som visas i blått i Fig. 2). Av dessa 17 proteiner finns det fem cytoskeletala proteiner (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb och Sept 2), fyra membranhandelsproteiner (Pacs1, Stx7, Snap25a och Rtn1), två GTP-bindande proteiner (Gnai2, Gnao1), två proteiner involverade i liten g-proteinsignalering (Farp2 och Cyfip1), tre signaladapterproteiner (rem, FABP7 och Crmp1) och en receptorkandidat (Clptm1).

de flesta av kandidaterna som anges i Fig. 3A avslöjade tidigare oupptäckta föreningar med tillväxtkottar och var funktionellt relaterade (Tabell 1). Sept2, Cap1 (ett g-aktinbindande protein), Snap25a och Cyfip1 har föreslagits spela roller i tillväxtkonbeteendet, baserat på studier i PC12-celler eller chick-eller Drosophila-neuroner (21-24), men deras exakta roller i däggdjurstillväxtkonen är inte kända. För de två GTP-bindande proteinerna (Gnai2, Gnao1) och regulatorn (Farp2) har involvering i reglering av ett tillväxtkonrespons på hämmare rapporterats, även om det inte är känt om de är nödvändiga eller oumbärliga för axonal tillväxt (25-27). Så vitt vi vet var ingen av de andra 10 proteinerna tidigare rapporterade att vara tillväxtkonregulatorer i däggdjursceller eller ryggradslösa modellorganismer som C. elegans eller Drosophila, även om deras paraloger kan vara relaterade till neurittillväxt . Vi sammanfattar kort den aktuella informationen om dessa proteiner i Tabell 1. Högst 3 av de 17 proteiner som identifierats i vår studie och testats med RNAi har tidigare varit inblandade i axonal tillväxt, vilket tyder på att vi lyckades effektivt identifiera ytterligare molekyler som är involverade i tillväxtkonfunktioner. Totalt pekar resultaten av RNAi-analys på 17 proteiner med högre eller liknande Fi-förhållanden än GAP-43, vilket gör dem starka kandidater för nya neuronala tillväxtassocierade proteiner (ngaps; refs. 4 och 30).

tillväxtkonen består av morfologiskt och funktionellt distinkta regioner som kallas de centrala (C) och perifera (P) regionerna (31). C-regionen är berikad i vesiklar och mikrotubuli och är förmodligen involverad i membranutvidgning för axonal tillväxt. P-regionen är berikad i aktinfilament och genererar förmodligen drivkraft. Använda tubulin som markör för C-regionen (Se Fig. S3) klassificerade vi markörproteinerna i fyra grupper: grupp i, lokaliserad övervägande i P-regionen; grupp II, detekterad i båda regionerna; grupp III, lokaliserad övervägande i C-regionen; och grupp IV, specifikt lokaliserad i C-regionen (Fig. 3B; se även fikon. S3 och S4).

de lokaliseringsmönster vi observerade var något annorlunda än vad som kunde ha förutsagts. Till exempel har Pacs1 rapporterats vara involverad i organellsortering men i axoner lokaliseras Pacs1 till P-regionen, där F-aktin berikas (Fig. 3B). Ett förmodat lösligt adapterprotein, rem, som har rapporterats som nedströms om TGF-Bisexuell signalering (32) och Clptm1, ett okänt transmembranprotein (33), är också lokaliserade i P-regionen. Däremot detekteras Sept 2 nära den tubulinpositiva regionen trots att det tidigare rapporterades att det finns i P-domänen i PC12-celler (21). Endast Rtn1, en er-protein och förmodad membranhandelsregulator (34), var specifikt lokaliserad i C-regionen, vilket gjorde den potentiellt användbar som en C-regionmarkör.