- Výsledky
- Rozsáhlé Identifikace Proteinů v Mozku Potkana Růstu Kužely.
- ověření lokalizace růstového kužele naznačuje zanedbatelnou falešně pozitivní rychlost.
- proteiny koncentrovanější v růstovém kuželu než v distálním axonu.
- RNAi analýza odhaluje význam pro délku axonu a funkční markery růstového kužele.
Výsledky
Rozsáhlé Identifikace Proteinů v Mozku Potkana Růstu Kužely.
Naším prvním cílem bylo identifikovat velké množství bílkovin vyjádřena v růstu šišky, včetně proteinů, společné pro mnoho typů buněk a bílkovin, podílí se na růstu kužel-zvláštní funkce. Za tímto účelem jsme nejprve oddělili proteiny od vyvíjejícího se předního mozku potkanů subcelulární frakcionací, abychom získali frakci GCP (obr. 1A). Poté jsme získali GCM hypotonickým ošetřením frakce GCP (viz podrobnosti v textu SI) s cílem identifikovat menší membránové proteiny v růstovém kuželu. Následně jsme použili multidimenzionální kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie (LC/MS/MS) k identifikaci jednotlivých proteinů ve vzorku, protože tato metoda se ukázala být vhodná pro rozsáhlé proteinové identifikace (15, 16). Metoda se ukázala jako účinná i v této studii s celkem 945 druhy proteinů identifikovaných v GCP a GCM (obr. 1B). Protože <50 proteinů byly dříve známy, musí být vyjádřeny v savčích růst kužel, identifikace této velké množství bílkovin, poskytuje nepřeberné množství molekulární informace o savčí růstu kužely (2, 4, 17). Pro srovnání, také jsme analyzovali dospělé synaptozomů, protějšek růstového kužele, a identifikovat 1,407 druhů synaptosomální proteiny (tj. dvakrát tolik, jak jsme zjistili, pro GCP a GCM). Přibližně 65% synaptosomálních proteinů, které jsme identifikovali, se nenachází v sadách GCP nebo GCM (obr. 1C), což může být proto, že velké množství bílkovin jsou nově syntetizovány a přidány do synaptické komponenty pro synaptického přenosu po synaptogenesis. Podařilo se nám identifikovat 96 a 141 proteinů v GCP nebo GCM, které nebyly nalezeny v synaptosomech (obr. 1C).
ověření lokalizace růstového kužele naznačuje zanedbatelnou falešně pozitivní rychlost.
dále jsme chtěli určit specificitu našeho proteomického přístupu, tj. Obecně by mělo být provedeno srovnání dané frakce s jinou biochemickou frakcí. Žádné frakce z vyvíjejícího se mozku však nelze připravit se srovnatelnou čistotou s frakcemi GCP nebo GCM. Abychom usnadnili generování srovnávacího souboru dat, provedli jsme systematickou imunodetekci podmnožiny proteinů v kultivovaných kortikálních neuronech (viz tabulka S4, tabulka S5, tabulka S6 a tabulka S7). Vyloučili jsme všudypřítomné nebo běžně exprimované proteiny, jako jsou metabolické enzymy a molekulární chaperony, abychom se místo toho mohli zaměřit na proteiny, které mohou být zvláště relevantní pro funkce specifické pro růstový kužel. Celkem jsme se zabývali distribucí 131 proteinů (tj. ≈15% proteinů, které jsme identifikovali). Data potvrzují, že v kultivovaných krysích kortikálních neuronech jsou všechny testované proteiny detekovatelné v oblasti růstového kužele (obr. 2 a tabulka S4). Ve skutečnosti žádné proteiny, které jsme testovali, nemohly být detekovány v jiných axonálních oblastech, ale ne v růstovém kuželu, což naznačuje velmi nízkou falešně pozitivní rychlost a potvrzuje náš celkový přístup. Kromě toho naše proteomická data v GCP nebo GCM neobsahovala žádné transkripční faktory, což naznačuje, že kontaminace jadernými složkami je také zanedbatelná (obr. 1D, tabulka S1 a tabulka S2).
obr. 2.
imunofluorescenční kvantifikace GCP. Horizontální osa, poměr FI (růstový kužel / distální axon), podélná osa, poměr plochy (růstový kužel/distální axon). Horizontální osa ukazuje GC akumulační index (poměr 1.0; vertikální černá tečkovaná čára označuje, že daný protein je rovnoměrně rozložena v distální axon versus růst kužel). Poměr FI pro GAP-43 (Gap43; 1.315) je zobrazen jako modrá Tečkovaná čára. Proteiny v pravé horní oblasti grafu jsou koncentrovanější v růstovém kuželu než v axonu. Mnohé z nich jsou proteiny vázající aktin a proteiny podílející se na vezikulárním obchodování. Poměr FI každého proteinu byl testován pomocí statistického testu Kruskal-Willis (46) s mezerou-43 jako srovnávacím bodem. Proteiny byly seskupeny na základě oboustranného 95% intervalu spolehlivosti, tj. byl vyšší než podobný nebo menší než GAP-43 (zobrazeno červeně, modře a černě). Všimněte si, že, jak se očekávalo, F-aktin (jako detekován s rhodamine phalloidin; červeně), která je soustředěna v růstu kužele a β-tubulin (zeleně), což je na vyšších úrovních v axonu, než v růstu kužele, jsou od sebe vzdálené na grafu. Podrobné informace naleznete v tabulce S4.
proteiny koncentrovanější v růstovém kuželu než v distálním axonu.
dále jsme se snažili určit, do jaké míry jsou proteiny identifikované v naší studii specifické nebo lokálně specifické pro růstový kužel. Za tímto účelem jsme porovnali distribuce proteinů v růstových kuželech s jejich distribucí v distálních axonech. Do té míry, že metoda je kvantitativní, jsme byli také schopni porovnat relativní koncentrace proteinů v růstových kuželech versus distální axony (obr. 2 a tabulka S4). Index akumulace růstového kužele jsme definovali jako poměr intenzity fluorescence (FI)v růstovém kuželu ve srovnání s indexem distálního axonu (obr. 2, Tabulka S4, text SI a obr. S1). Poměr plochy, ke zkoumání distribučních vzorců každého proteinu (obr. S2). Index akumulace růstového kužele je indikací relativní úrovně akumulace bílkovin v růstovém kuželu. Použitím statistických Wilcoxonův rank-sum test, aby naše výsledky, usnadňuje přísná klasifikace zkoumaných proteinů v porovnání s GAP-43, naše kvantifikaci systematické immunostaining přístup pomocí tohoto indexu vyplynulo, že tolik jako 69 proteiny identifikovány proteomika byly zjištěny na vyšší úrovni v růstu kužel prostoru, než v distální části axonu. Zdá se, že tyto proteiny jsou v růstových kuželech na mnohem vyšších úrovních než v současné době stanovená proteinová mezera markerů růstového kužele-43 (7) (obr. 2, zobrazeno červeně). Také jsme zjistili, že pro 33 proteinů se oblasti statistických chyb překrývají s oblastmi GAP-43, takže tuto sadu proteinů kategorizujeme jako koncentrovanou v růstovém kuželu v podobné míře jako GAP-43 (obr. 2, zobrazeno modře).
RNAi analýza odhaluje význam pro délku axonu a funkční markery růstového kužele.
použili jsme přístup založený na RNAi k testování rolí kandidátů markerových proteinů v axonálním růstu. Axonální růst vyvolávající aktivitu byl hodnocen měřením axonální délky (Viz Text SI; pro potvrzení knockdownu a specificity viz také obr. S1). Vybrali jsme 68 genů pro léčbu RNAi a zjistili jsme, že narušení 17 z nich vedlo ke kratší axonální délce aplikací přísného neparametrického testu, tj. 3a, Tabulka 1 a tabulka S8). 17 proteinů kategorizujeme jako domnělé markery funkčního růstového kužele (Tabulka 1). Vzhledem k výsledkům kvantitativního imunostainingu (obr. 2) lze tyto proteiny klasifikovat na proteiny koncentrovanější než GAP-43 (proteiny znázorněné červeně na obr. 2) nebo podobné GAP-43 (proteiny znázorněné modře na obr. 2). Z těchto 17 proteiny, je jich tam pět cytoskeletální proteiny (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb, a Sept 2), čtyři membrány obchodování proteiny (Pacs1, Stx7, Snap25a, a Rtn1), dva GTP-vazebné proteiny (Gnai2, Gnao1), dva proteiny zapojené v malé G proteinové signalizace (Farp2 a Cyfip1), tři signalizační adaptér proteiny (Popruh, FABP7, a Crmp1), a jeden receptor kandidát (Clptm1).
obr. 3.
identifikace Ngap pomocí RNAi. (A) geny ovlivňující růst axonů. Role identifikovaných proteinů v aktivitě růstového kužele byly testovány hledáním redukce axonálního růstu vyvolané RNAi. RNAi byla provedena tak, jak je popsáno (45). Osm proteinů vlevo šrafované linky mají FI poměry vynikající pro GAP-43 jako statisticky posuzována pomocí Kruskal-Willis test (červené; také zobrazeny červeně na Obr. 2) a devět proteinů napravo od šrafované linie má Fi poměry podobné poměru GAP-43, jak bylo posuzováno stejným testem. Jako kontrola byly použity axonální délky neuronů pozitivních na EGFP (bez siRNA) (Modrá; také znázorněno modře na obr. 2). Všechny siRNA (kromě GFP) mají P < 0,002 v testu Wilcoxon rank-sum (vs. kontrola) (46). Údaje jsou zobrazeny jako průměr ± SEM. Počet měřených neuronů je uveden v dolní části každé lišty. (B) klasifikace kandidátských markerových proteinů růstového kužele imunologizací. Definovali jsme domény C A P růstového kužele pomocí kvantitativní analýzy imunostainingových obrazů (diagram nahoře; Viz Text SI a obr. S2). Proteiny jsme rozdělili do čtyř skupin: skupina I (např. Pacs1), převážně lokalizované v oblasti P (C P); skupina II (ex. Syx7), detekovaný v oblastech C I P (C ≃ P); skupina III (ex. Gnai2), převážně lokalizované do oblasti C (C ≫ P); a skupina IV (ex. Rtn1), specificky lokalizované v oblasti C (C). V každém případě je levý diagram shrnutím typické distribuce proteinů pro každou skupinu. Imunofluorescenční mikrografy detekce antikandidátových proteinových protilátek v kultivovaných kortikálních neuronech potkanů jsou zobrazeny v a.purpurové a zelené zobrazení antigenního proteinu a α-tubulinu. Vzdálené pohledy ukazují sloučený obrázek. Tři skupiny (skupiny I-III) jsou také uvedeny v legendě pro obr. S4. Všimněte si, že α-tubulin je primárně detekován v axonu, i když je také detekovatelný v centrální oblasti růstového kužele. Viz tabulka 1 pro podrobnou charakterizaci každého proteinu a zkrácených názvů. (Stupnice: 10 µm.)
zobrazit tuto tabulku:
- Zobrazit inline
- zobrazit vyskakovací okno
Tabulka 1.
Noví kandidáti na nGAPs
většina kandidátů uvedených na obr. 3A odhalila dříve nezjištěná spojení s růstovými kužely a byla funkčně příbuzná (Tabulka 1). Sept2, Cap1 (G-aktin-vázající protein), Snap25a, a Cyfip1 bylo navrženo, aby hrát roli v růstu kužel chování, na základě studií v PC12 buňkách nebo holka nebo Drosophila neuronů (21-24), ale jejich přesná role v savčích růst kužel nejsou známy. Pro dva GTP-vazebné proteiny (Gnai2, Gnao1) a regulátor (Farp2), zapojení do regulace růstu kužel reakce na inhibitory byl hlášen, ačkoli není známo, zda jsou nutné či nezbytné pro axonální růst (25-27). Pro našeho nejlepšího vědomí, žádný z dalších 10 proteiny byly dříve hlášeny být růst kužel regulátory v buňkách savců nebo bezobratlých modelových organismů, jako je C. elegans nebo Drosophila, i když jejich paralogues mohou souviset s neurite růst . Stručně shrneme aktuální informace o těchto proteinech v tabulce 1. Nejvíce 3 z 17 proteiny identifikované v naší studii a testované s RNAi byly dříve zapojeny do axonálního růstu, což naznačuje, že se nám podařilo účinně identifikovat další molekuly zapojené do funkcí růstového kužele. Celkem, výsledky RNAi analýza bodu na 17 proteiny s vyšší nebo podobný FI poměry než GAP-43, což je silné kandidáty pro nové neuronální růst-asociovaných proteinů (nGAPs; refs. 4 a 30).
růstový kužel se skládá z morfologicky a funkčně odlišných oblastí označovaných jako centrální (C) a periferní (P) regiony (31). Oblast C je obohacena o vezikuly a mikrotubuly a pravděpodobně se podílí na expanzi membrány pro růst axonů. Oblast P je obohacena aktinovými vlákny a pravděpodobně vytváří hnací sílu. Použití tubulinu jako markeru pro oblast C (viz obr. S3), jsme klasifikovány značku proteinů do čtyř skupin: skupina I, lokalizované převážně v P regionu; skupina II, zjištěné v obou regionech; skupina III, lokalizované převážně v C oblasti; a skupina IV, konkrétně lokalizovány v C oblasti (Obr. 3B; viz též obr. S3 a S4).
vzory lokalizace, které jsme pozorovali, se poněkud lišily od toho, co bylo možné předvídat. Například Pacs1 se údajně podílí na třídění organel, ale v axonech se Pacs1 lokalizuje do oblasti P, kde je obohacen F-aktin (obr. 3B). Domnělý rozpustné adaptér bílkovin, Popruh, která byla nahlášena jako downstream TGF-β signalizace (32), a Clptm1, neznámý transmembránový protein (33), jsou také lokalizovány v P regionu. Naproti tomu 2.září je detekováno v blízkosti oblasti pozitivní na tubulin, přestože bylo dříve hlášeno, že se nachází v doméně P v buňkách PC12 (21). Pouze Rtn1, er protein a domnělý regulátor membránového obchodování (34), byl specificky lokalizován v oblasti C, což je potenciálně užitečné jako marker oblasti C.
