Funktionaalisten merkkiproteiinien tunnistaminen nisäkkäiden kasvukartiossa

Kasvukartion lokalisoinnin todentaminen viittaa vähäiseen väärien positiivisten tulosten määrään.

halusimme seuraavaksi määrittää proteomiikan lähestymistapamme spesifisyyden, eli määrittää epätosipositiivisuuden. Yleensä tiettyä fraktiota on verrattava toiseen biokemialliseen fraktioon. Kehittyvistä aivoista ei kuitenkaan voida valmistaa fraktioita, joiden puhtaus olisi verrattavissa GCP-tai GCM-fraktioihin. Näin ollen vertailutietojen luomisen helpottamiseksi suoritimme systemaattisen immunodetektion osajoukolle viljellyissä aivokuoren neuroneissa olevista proteiineista (KS.taulukko S4, taulukko S5, taulukko S6 ja taulukko S7). Jätimme pois kaikkialla esiintyvät tai yleisesti ilmentyvät proteiinit, kuten metaboliaentsyymit ja molekyylikassit, jotta voisimme sen sijaan keskittyä proteiineihin, jotka saattavat olla erityisen merkityksellisiä kasvukartion spesifisten toimintojen kannalta. Tarkastelimme yhteensä 131 proteiinin jakaumia (ts. ≈15% tunnistamistamme proteiineista). Tiedot vahvistavat, että rotan aivokuoren hermosoluissa kaikki testaamamme proteiinit ovat havaittavissa kasvukartion alueella (Kuva. 2 ja taulukko S4). Testaamiamme proteiineja ei havaittu muilla aksonaalialueilla, mutta ei kasvukartiossa, mikä viittaa hyvin alhaiseen väärien positiivisten määrään ja vahvistaa yleistä lähestymistapaamme. Lisäksi proteomitiedoissamme GCP: ssä tai GCM: ssä ei ollut transkriptiotekijöitä, mikä viittaa siihen, että kontaminaatio ydinkomponenteilla on myös vähäpätöinen (Fig. 1D, taulukko S1 ja taulukko S2).

proteiineja on enemmän Kasvukartiossa kuin distaalisessa Aksonissa.

yritimme seuraavaksi selvittää, missä määrin tutkimuksessamme tunnistetut proteiinit ovat kasvukartiolle spesifisiä tai paikallisesti spesifisiä. Tätä varten vertasimme proteiinien jakautumista kasvukartioissa niiden jakautumiseen distaalisissa aksoneissa. Siinä määrin kuin menetelmä on kvantitatiivinen, pystyimme myös vertaamaan kasvukartioiden proteiinien suhteellisia pitoisuuksia distaalisiin aksoneihin (viikuna. 2 ja taulukko S4). Määrittelimme kasvukartion kertymäindeksin kasvukartion fluoresenssin intensiteetin (FI) suhteena distaaliseen aksoniin (Fig. 2, taulukko S4, si teksti ja kuva. S1). Käytimme myös toista indeksiä eli pinta-alan suhdelukua tutkiaksemme kunkin proteiinin jakaantumistapoja (Kuva. S2). Kasvukartion kertymisindeksi on osoitus kasvukartion proteiinin suhteellisen kertymisen tasosta. Soveltamalla tilastollista Wilcoxon rank-sum-testiä tuloksiimme, helpottaen tutkittujen proteiinien tiukkaa luokittelua GAP-43: een, systemaattisen immunostisoivan lähestymistavan kvantifiointi tämän indeksin avulla paljasti, että jopa 69 proteomiikan tunnistamaa proteiinia havaittiin korkeammilla tasoilla kasvukartion alueella kuin distaalisessa aksonissa. Nämä proteiinit näyttävät olevan paljon korkeammalla tasolla kasvukartioissa kuin nykyisin vakiintunut kasvukartiomarkkeriproteiini GAP-43 (7) (Kuva. 2, esitetty punaisella). Havaitsimme myös, että 33 valkuaisaineelle tilastolliset virhealueet ovat päällekkäisiä GAP-43: n kanssa, joten luokittelemme tämän valkuaisainejoukon keskittyneeksi kasvukartioon samassa määrin kuin GAP-43 (Kuva. 2, esitetty sinisellä).

RNAi-analyysi paljastaa relevanssin Kasvukartion Aksonipituuteen ja funktionaalisiin markkereihin.

käytimme RNAi-pohjaista lähestymistapaa testataksemme markkeriproteiinikandidaattien roolia aksonaalisessa kasvussa. Aktiivisuutta indusoiva aksonaalinen kasvu arvioitiin mittaamalla aksonaalinen pituus (KS.SI-teksti; knockdownin ja spesifisyyden varmistaminen KS. myös kuva. S1). Valitsimme 68 geeniä RNAi-hoitoon ja havaitsimme, että 17: n häiriöt johtivat lyhyempään aksonaaliseen pituuteen soveltamalla tiukkaa nonparametrista testiä eli Kruskal-Willis-testiä (Kuva. 3A, Taulukko 1 ja taulukko S8). Luokittelemme 17 proteiinia oletettaviksi funktionaalisiksi kasvukartion markkereiksi (Taulukko 1). Kvantitatiivisten immunostisoivien tulosten huomioon ottaminen (Kuva. 2), nämä proteiinit voidaan luokitella proteiineihin, jotka ovat keskittyneempiä kuin GAP-43 (proteiinit näkyvät punaisella Kuvassa. 2) tai samanlainen kuin GAP-43 (proteiinit kuvassa sinisenä. 2). Näistä 17 proteiinista on viisi sytoskeletaaliproteiinia (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb ja Sept 2), neljä kalvoproteiinia (Pacs1, Stx7, Snap25a ja Rtn1), kaksi GTP: tä sitovaa proteiinia (Gnai2, Gnao1), kaksi pientä G-proteiinin signalointiin osallistuvaa proteiinia (Farp2 ja Cyfip1), kolme signalointisovitinproteiinia (Strap, FABP7 ja Crmp1) ja yksi reseptorikandidaatti (Clptm1).

suurin osa ehdokkaista lueteltu Fig. 3A havaittiin aiemmin havaitsemattomia yhteyksiä kasvukartioiden kanssa ja ne liittyivät toiminnallisesti toisiinsa (Taulukko 1). Sept2: n, Cap1: n (g-aktiinia sitova proteiini), Snap25a: n ja Cyfip1: n on ehdotettu näyttelevän roolia KASVUKARTION käyttäytymisessä PC12-soluissa tai poikasen tai Drosophila-neuroneissa (21-24) tehtyjen tutkimusten perusteella, mutta niiden tarkkaa roolia nisäkkäiden kasvukartiossa ei tunneta. Kahden GTP: tä sitovan proteiinin (Gnai2, Gnao1) ja säätelijäproteiinin (Farp2) on raportoitu osallistuvan inhibiittorien aiheuttaman kasvukartion säätelyyn, vaikka ei tiedetä, ovatko ne aksonaalisen kasvun kannalta välttämättömiä (25-27). Parhaan tietomme mukaan yhdenkään muun 10 proteiinin ei aiemmin raportoitu olevan kasvukartion säätelijöitä nisäkässoluissa tai selkärangattomissa malliorganismeissa, kuten C. elegansissa tai Drosophilassa, joskin niiden paralogit saattavat liittyä neuriittien kasvuun . Tiivistämme lyhyesti tämänhetkiset tiedot näistä proteiineista taulukossa 1. Enintään 3 tutkimuksessamme tunnistetuista ja RNAi: lla testatuista 17 proteiinista on aiemmin yhdistetty aksonaaliseen kasvuun, mikä viittaa siihen, että onnistuimme tunnistamaan tehokkaasti muita kasvukartion toimintoihin osallistuvia molekyylejä. RNAi-analyysin tulokset viittaavat yhteensä 17 proteiiniin, joilla on suurempi tai samankaltainen FI-suhde kuin GAP-43: lla, mikä tekee niistä vahvoja ehdokkaita uusille hermosolukasvuun liittyville proteiineille (nGAPs; refs). 4 ja 30).

kasvukartio koostuu morfologisesti ja toiminnallisesti erillisistä alueista, joita kutsutaan keskus – (C) ja reuna – (P) alueiksi (31). C-alue on rikastunut vesikkeleillä ja mikrotubuluksilla ja on todennäköisesti mukana kalvon laajenemisessa aksonaalikasvua varten. P-alue on rikastettu aktiinifilamenteilla ja todennäköisesti se tuottaa motiivivoimaa. Tubuliinin käyttäminen C-alueen merkkiaineena (KS. S3), luokittelimme merkkiproteiinit neljään ryhmään: ryhmä I, lokalisoitu pääasiassa P-alueella; ryhmä II, havaittu molemmilla alueilla; ryhmä III, lokalisoitu pääasiassa C-alueella; ja ryhmä IV, erityisesti lokalisoitu C-alueella (Kuva. 3B; Katso myös viikunoita. S3 ja S4).

havaitsemamme lokalisaatiomallit poikkesivat jonkin verran siitä, mitä olisi voitu ennustaa. Esimerkiksi Pacs1: n on raportoitu osallistuvan organellilajitteluun, mutta aksoneissa Pacs1 paikallistaa P-alueelle, jossa f-aktiini rikastuu (Fig. 3b). P-alueella on myös paikallinen liukeneva adapteriproteiini, Strap, jonka on raportoitu olevan TGF-β-signaloinnin (32) loppupäässä, ja clptm1, tuntematon transmembraaniproteiini (33). Sitä vastoin 2. syyskuuta havaitaan lähellä tubuliinipositiivista aluetta, vaikka sitä aiemmin raportoitiin olevan P-domeenissa PC12-soluissa (21). Ainoastaan Rtn1, ER-proteiinin ja oletetun kalvojen salakuljetuksen säätelijä (34), paikallistettiin erityisesti C-alueelle, mikä tekee siitä mahdollisesti käyttökelpoisen C-alueen merkkiaineena.