Identificação de proteínas marcadores funcionais no cone de crescimento de mamíferos

a verificação da localização do Cone de crescimento sugere uma taxa negligenciável de falsos positivos.

em seguida, queríamos determinar a especificidade da nossa abordagem Proteómica, ou seja, determinar a taxa de falsos positivos. Geralmente, uma comparação de uma dada fração deve ser feita para outra fração bioquímica. No entanto, nenhuma fração do cérebro em desenvolvimento pode ser preparada com pureza comparável às frações GCP ou GCM. Assim, para facilitar a geração de um conjunto de dados de comparação, realizamos imunodetecção sistemática de um subconjunto das proteínas em neurónios corticais cultivados (ver tabela S4, tabela S5, tabela S6, e tabela S7). Excluímos proteínas onipresentes ou comumente expressas, tais como enzimas metabólicas e Acompanhantes moleculares, para que pudéssemos, em vez disso, concentrar-nos em proteínas que podem ser particularmente relevantes para funções específicas do cone de crescimento. No total, nós olhamos para as distribuições de 131 proteínas (i.e., ≈15% das proteínas que identificamos). Os dados confirmam que nos neurónios corticais do rato cultivados todas as proteínas testadas são detectáveis na área do cone de crescimento (Fig. 2 e quadro S4). De fato, nenhuma proteína que testamos poderia ser detectada em outras regiões axonais, mas não no cone de crescimento, sugerindo uma taxa muito baixa de falsos positivos e validando nossa abordagem geral. Além disso, nossos dados proteômicos em GCP ou GCM não continham fatores de transcrição, sugerindo que a contaminação com componentes nucleares também é negligenciável (Fig. 1D, quadro S1 e quadro S2).

proteínas mais concentradas no Cone de crescimento do que no Axon Distal.Em seguida, procurámos determinar em que medida as proteínas identificadas no nosso estudo são específicas ou localmente específicas do cone de crescimento. Para fazer isso, comparamos as distribuições das proteínas em cones de crescimento com sua distribuição em axônios distais. Na medida em que o método é quantitativo, também fomos capazes de comparar as concentrações relativas de proteínas em cones de crescimento versus axões distais (Fig. 2 e quadro S4). Definimos o índice de acumulação do cone de crescimento como a razão de intensidade de fluorescência (FI) no cone de crescimento em comparação com o axon distal (Fig. 2, Table S4, SI Text, and Fig. S1). Nós também usamos outro índice, isto é, a razão de área, para examinar os padrões de distribuição de cada proteína (Fig. S2). O índice de acumulação do cone de crescimento é uma indicação do nível relativo de acumulação de proteínas no cone de crescimento. Ao aplicar o teste estatístico Wilcoxon rank-sum aos nossos resultados, facilitando a classificação estrita das proteínas examinadas em comparação com GAP-43, a nossa quantificação da abordagem sistemática de imunocontenção usando este índice revelou que até 69 proteínas identificadas pela Proteómica foram detectadas em níveis mais elevados na área do cone de crescimento do que no axon distal. Estas proteínas parecem estar a níveis muito mais elevados nos cones de crescimento do que o marcador proteico do cone de crescimento actualmente estabelecido GAP-43 (7) (Fig. 2, a vermelho). Nós também descobrimos que para 33 proteínas as áreas de erro estatístico se sobrepõem com a de GAP-43, assim categorizamos este conjunto de proteínas como concentradas no cone de crescimento em um grau similar ao GAP-43 (Fig. 2, mostrado em azul).

a análise RNAi revela relevância para o comprimento dos axônios e marcadores funcionais do Cone de crescimento.

usámos uma abordagem baseada em RNAi para testar os papéis dos candidatos a proteínas marcadores no crescimento axonal. O crescimento axonal induzido pela actividade foi avaliado através da medição do comprimento axonal (ver texto do SI; para confirmação de knockdown e especificidade, ver também Fig. S1). Selecionamos 68 genes para o tratamento RNAi e descobrimos que a ruptura de 17 deles levou a uma menor duração axonal, através da aplicação de um rigoroso teste não paramétrico, ou seja, o teste de Kruskal-Willis (Fig. 3A, Quadro 1, e quadro S8). Categorizamos as 17 proteínas como marcadores de cone de crescimento funcional putativo (Tabela 1). Considerando os resultados da imunossupressão quantitativa (Fig. 2), estas proteínas podem ser classificadas em proteínas mais concentradas do que GAP-43 (proteínas mostradas em vermelho na Fig. 2) ou semelhantes ao GAP-43(proteínas apresentadas em azul na Fig. 2). Desses 17 de proteínas, existem cinco proteínas do citoesqueleto (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb, Setembro, 2), quatro membrana tráfico de proteínas (Pacs1, Stx7, Snap25a, e Rtn1), dois GTP-proteínas de ligação (Gnai2, Gnao1), duas proteínas envolvidas na pequena G de proteína de sinalização (Farp2 e Cyfip1), três de sinalização placa de proteínas (Correia, FABP7, e Crmp1), e um receptor candidato (Clptm1).

a Maioria dos candidatos listados na Fig. 3A revelaram associações anteriormente não detectadas com cones de crescimento e estavam funcionalmente relacionadas (Quadro 1). Sept2, Cap1( uma proteína de ligação de G-actin), Snap25a, e Cyfip1 têm sido sugeridos para desempenhar papéis no comportamento do cone de crescimento, com base em estudos em células PC12 ou neurônios de pintos ou Drosophila (21-24), mas seus papéis precisos no cone de crescimento mamífero não são conhecidos. Para os dois GTP-proteínas de ligação (Gnai2, Gnao1) e o regulador (Farp2), o envolvimento na regulação do crescimento cone resposta a inibidores tem sido relatada, embora não se sabe se são necessárias ou indispensáveis para o crescimento axonal (25-27). Tanto quanto sabemos, nenhuma das outras 10 proteínas eram anteriormente relatadas como reguladores de cones de crescimento em células de mamíferos ou organismos de modelo Invertebrado, como C. elegans ou Drosophila, embora seus paralogos possam estar relacionados ao crescimento de neurite . Resumimos brevemente a informação atual sobre essas proteínas na Tabela 1. No máximo 3 das 17 proteínas identificadas no nosso estudo e testadas com RNAi foram previamente implicadas no crescimento axonal, sugerindo que conseguimos uma identificação eficiente de moléculas adicionais envolvidas nas funções do cone de crescimento. No total, os resultados da análise RNAi apontam para 17 proteínas com rácios de FI mais elevados ou semelhantes do que GAP-43, tornando-as fortes candidatas a novas proteínas associadas ao crescimento neuronal (nGAPs; refs. 4 e 30).

o cone de crescimento é constituído por regiões morfologicamente e funcionalmente distintas referidas como regiões centrais (C) e periféricas (P) (31). A região C é enriquecida em vesículas e microtúbulos e está provavelmente envolvida na expansão da membrana para o crescimento axonal. A região P é enriquecida em filamentos de actina e provavelmente gera força motriz. Utilizar a tubulina como marcador para a região C (ver Fig. S3), classificámos o marcador de proteínas em quatro grupos: grupo I, localizadas predominantemente na região; grupo II, detectado em ambas as regiões; grupo III, localizadas predominantemente na região C; e grupo IV, especificamente localizadas na região C (Fig. 3B; ver também figos. S3 e S4).

os padrões de localização observados eram um pouco diferentes do que poderia ter sido previsto. Por exemplo, o Pacs1 tem sido relatado estar envolvido na triagem de organelas, mas em axões, o Pacs1 localiza-se na região P, Onde o F-actin é enriquecido (Fig. 3B). Uma proteína putativa solúvel adaptadora, Strap, que foi relatada como a jusante da sinalização TGF-β (32), e Clptm1, uma proteína transmembranar desconhecida (33), também estão localizadas na região P. Em contraste, o Sept 2 é detectado perto da região tubulina-positivo, apesar do fato de que foi anteriormente relatado para ser encontrado no domínio P em células PC12 (21). Apenas o Rtn1, uma proteína ER e regulador do tráfico de membranas putativas (34), foi especificamente localizado na região C, tornando-o potencialmente útil como marcador de Região C.