Identificazione di proteine marker funzionali nel cono di crescita dei mammiferi

La verifica della localizzazione del cono di crescita suggerisce un tasso di falsi positivi trascurabile.

Abbiamo poi voluto determinare la specificità del nostro approccio proteomica,; cioè, per determinare il tasso di falsi positivi. Generalmente, un confronto di una data frazione dovrebbe essere fatto con un’altra frazione biochimica. Tuttavia, nessuna frazione del cervello in via di sviluppo può essere preparata con purezza paragonabile alle frazioni GCP o GCM. Pertanto, per facilitare la generazione di un set di dati di confronto, abbiamo eseguito l’immunodetezione sistematica di un sottoinsieme delle proteine nei neuroni corticali in coltura (vedere Tabella S4, Tabella S5, Tabella S6 e Tabella S7). Abbiamo escluso proteine ubiquitarie o comunemente espresse come enzimi metabolici e chaperoni molecolari in modo che potremmo invece concentrarci su proteine che potrebbero essere particolarmente rilevanti per le funzioni specifiche del cono di crescita. In totale, abbiamo esaminato le distribuzioni di 131 proteine (cioè ≈15% delle proteine che abbiamo identificato). I dati confermano che nei neuroni corticali di ratto in coltura tutte le proteine che abbiamo testato sono rilevabili nell’area del cono di crescita (Fig. 2 e Tabella S4). In effetti, nessuna proteina che abbiamo testato potrebbe essere rilevata in altre regioni assonali ma non nel cono di crescita, suggerendo un tasso di falsi positivi molto basso e convalidando il nostro approccio generale. Inoltre, i nostri dati proteomici in GCP o GCM non contenevano fattori di trascrizione, suggerendo che anche la contaminazione con componenti nucleari è trascurabile (Fig. 1D, Tabella S1 e Tabella S2).

Proteine più concentrate nel cono di crescita che nell’Assone distale.

Abbiamo quindi cercato di determinare la misura in cui le proteine identificate nel nostro studio sono specifiche o localmente specifiche del cono di crescita. Per fare questo, abbiamo confrontato le distribuzioni delle proteine nei coni di crescita con la loro distribuzione negli assoni distali. Nella misura in cui il metodo è quantitativo, siamo stati anche in grado di confrontare le concentrazioni relative di proteine nei coni di crescita rispetto agli assoni distali (Fig. 2 e Tabella S4). Abbiamo definito l’indice di accumulo del cono di crescita come il rapporto tra l’intensità della fluorescenza (FI) nel cono di crescita rispetto a quello nell’assone distale (Fig. 2, Tabella S4, Testo SI e Fig. S1). Abbiamo anche usato un altro indice, cioè il rapporto di area, per esaminare i modelli di distribuzione di ciascuna proteina (Fig. S2). L’indice di accumulo del cono di crescita è un’indicazione del livello relativo di accumulo di proteine nel cono di crescita. Applicando il test statistico Wilcoxon rank-sum ai nostri risultati, facilitando una classificazione rigorosa delle proteine esaminate rispetto a GAP-43, la nostra quantificazione dell’approccio immunostenante sistematico utilizzando questo indice ha rivelato che ben 69 proteine identificate dalla proteomica sono state rilevate a livelli più elevati nell’area del cono di crescita rispetto all’assone distale. Queste proteine sembrano essere a livelli molto più alti nei coni di crescita rispetto al GAP proteico marker cono di crescita attualmente stabilito-43 (7) (Fig. 2, mostrato in rosso). Abbiamo anche scoperto che per 33 proteine le aree di errore statistico si sovrappongono a quella di GAP-43, quindi classifichiamo questo insieme di proteine concentrate nel cono di crescita in misura simile a GAP-43 (Fig. 2, mostrato in blu).

L’analisi RNAi rivela rilevanza per la lunghezza degli assoni e i marcatori funzionali del cono di crescita.

Abbiamo utilizzato un approccio basato su RNAi per testare i ruoli dei candidati alle proteine marker nella crescita assonale. La crescita assonale che induce attività è stata valutata misurando la lunghezza assonale (vedere il testo SI; per la conferma di knockdown e specificità, vedere anche Fig. S1). Abbiamo selezionato 68 geni per il trattamento RNAi e abbiamo scoperto che l’interruzione di 17 di essi ha portato a una lunghezza assonale più breve, mediante l’applicazione di un test non parametrico rigoroso, cioè il test di Kruskal-Willis (Fig. 3A, Tabella 1 e Tabella S8). Classifichiamo le 17 proteine come marcatori di cono di crescita funzionale putativi (Tabella 1). Considerando i risultati dell’immunostenante quantitativo (Fig. 2), queste proteine possono essere classificate in proteine più concentrate di GAP-43 (proteine mostrate in rosso in Fig. 2) o simile a GAP-43 (proteine mostrate in blu in Fig. 2). Di questi 17 proteine, ci sono cinque le proteine del citoscheletro (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb, e 2 Settembre), quattro traffico di membrana proteine (Pacs1, Stx7, Snap25a, e Rtn1), due GTP-binding proteins (Gnai2, Gnao1), due proteine coinvolte nella piccola G di proteine di segnalazione (Farp2 e Cyfip1), tre di segnalazione scheda di proteine (Cinghia, FABP7, e Crmp1), e uno recettore candidato (Clptm1).

La maggior parte dei candidati elencati in Fig. 3A ha rivelato associazioni precedentemente non rilevate con coni di crescita ed erano funzionalmente correlate (Tabella 1). Sept2, Cap1 (una proteina legante G-actina), Snap25a e Cyfip1 sono stati suggeriti per svolgere ruoli nel comportamento del cono di crescita, sulla base di studi sulle cellule PC12 o sui neuroni chick o Drosophila (21-24), ma i loro ruoli precisi nel cono di crescita dei mammiferi non sono noti. Per le due proteine leganti il GTP (Gnai2, Gnao1) e il regolatore (Farp2), è stato riportato un coinvolgimento nella regolazione della risposta di un cono di crescita agli inibitori, sebbene non sia noto se siano necessari o indispensabili per la crescita assonale (25-27). Per quanto ne sappiamo, nessuna delle altre proteine 10 è stata precedentemente segnalata come regolatori del cono di crescita in cellule di mammiferi o organismi modello di invertebrati come C. elegans o Drosophila, sebbene i loro paraloghi possano essere correlati alla crescita dei neuriti . Riassumiamo brevemente le informazioni attuali su queste proteine nella Tabella 1. Al massimo 3 delle 17 proteine identificate nel nostro studio e testate con RNAi sono state precedentemente implicate nella crescita assonale, suggerendo che siamo riusciti a identificare efficacemente molecole aggiuntive coinvolte nelle funzioni del cono di crescita. In totale, i risultati dell’analisi RNAi indicano proteine 17 con rapporti FI più alti o simili rispetto a GAP-43, rendendole candidati forti per nuove proteine associate alla crescita neuronale (nGAPs; refs. 4 e 30).

Il cono di crescita è costituito da regioni morfologicamente e funzionalmente distinte denominate regioni centrali (C) e periferiche (P) (31). La regione C è arricchita in vescicole e microtubuli ed è probabilmente coinvolta nell’espansione della membrana per la crescita assonale. La regione P è arricchita in filamenti di actina e probabilmente genera forza motrice. Utilizzo della tubulina come marker per la regione C (vedi Fig. S3), abbiamo classificato le proteine marker in quattro gruppi: gruppo I, localizzato prevalentemente nella regione P; gruppo II, rilevato in entrambe le regioni; gruppo III, localizzato prevalentemente nella regione C; e gruppo IV, specificamente localizzato nella regione C (Fig. 3B; vedi anche Figg. S3 e S4).

I modelli di localizzazione che abbiamo osservato erano leggermente diversi da quelli che avrebbero potuto essere previsti. Ad esempio, Pacs1 è stato segnalato per essere coinvolto nello smistamento degli organelli, ma negli assoni, Pacs1 si localizza nella regione P, dove la F-actina è arricchita (Fig. 3 TER). Una proteina adattatore solubile putativa, Cinghia, che è stata riportata come a valle della segnalazione TGF-β (32), e Clptm1, una proteina transmembrana sconosciuta (33), sono localizzate anche nella regione P. Al contrario, il 2 settembre viene rilevato vicino alla regione tubulina-positiva nonostante il fatto che in precedenza fosse stato segnalato per essere trovato nel dominio P nelle cellule PC12 (21). Solo Rtn1, una proteina ER e un presunto regolatore del traffico di membrana (34), è stato specificamente localizzato nella regione C, rendendolo potenzialmente utile come marker della regione C.