결과
쥐 뇌 성장 콘에서 단백질의 대규모 식별.
우리의 첫 번째 목표는 많은 세포 유형 및 성장 콘 특정 기능에 관련 된 단백질에 일반적인 단백질을 포함 하 여 성장 콘에서 표현 하는 단백질의 많은 수를 식별 했다. 이를 위해 우리는 먼저 세포 내 분별 화를 통해 개발중인 쥐의 전뇌에서 단백질을 분리하여 분획 분획(그림 1)을 얻었다. 1). 우리는 성장 원뿔에서 작은 막 단백질을 식별 하는 것을 목표로(시 텍스트에서 세부 정보 참조)의 저장 성 치료를 통해 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 유전자 변형 이 방법은 대규모 단백질 식별(15,16)에 적합 한 것으로 표시 되었습니다 때문에 샘플에서 독특한 단백질을 식별 하기 위해 다차원 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석을 사용 합니다. 이 방법은 본 연구에서도 강력한 것으로 입증되었으며,총 945 종의 단백질이 확인되었습니다. 1 비). 단백질의<50 은 이전에 포유류 성장 원뿔에서 표현 된 것으로 알려져 있었기 때문에,이 많은 수의 단백질을 식별하면 포유류 성장 원뿔에 대한 풍부한 분자 정보를 제공합니다(2,4,17). 비교를 위해,우리는 또한 성장 원뿔의 대응 물인 성인 시냅토좀을 분석하고 1,407 종의 시냅토 좀 단백질(즉,우리가 발견 한 것보다 두 배 많은)을 확인했습니다. 우리가 확인한 시냅토솜 단백질의 약 65%는 유전자좌피 또는 유전자좌피 세트(그림 1)에서 발견되지 않는다. 많은 수의 단백질이 새로 합성되어 시냅스 생성 후 시냅스 전달을 위해 시냅스 성분에 첨가되기 때문일 수 있습니다. 우리는 시 냅 토 좀(그림 1)에서 발견 되지 않은 각각,96 및 141 단백질 식별에 성공 했다. 1 기음).
성장 원뿔 국소화의 검증은 무시할 수있는 위양성 비율을 시사합니다.
우리는 다음 우리의 프로테오믹스 접근;의 특이성을 확인 하 고 싶 었 즉,거짓 긍정적인 속도 확인 합니다. 일반적으로 주어진 분획을 다른 생화학 분획과 비교해야합니다. 그러나 발달중인 뇌에서 나온 분획물은 그 분획물 또는 그 분획물과 비슷한 순도로 준비 될 수 없습니다. 따라서,비교 데이터 집합의 생성을 용이 하 게 하기 위해 우리가 배양된 대뇌 피 질 신경 세포에서 단백질의 하위 집합의 체계적인 면역 탐지를 수행 했다(표 참조 4,표 5,표 6,및 표 7). 우리는 대사 효소 및 분자 보호자와 같은 유비쿼터스 또는 일반적으로 표현 된 단백질을 배제하여 성장 원뿔 관련 기능과 특히 관련이있을 수있는 단백질에 초점을 맞출 수 있도록했습니다. 전체적으로 우리는 131 개의 단백질(즉,우리가 확인한 단백질의 15%)의 분포를 조사했습니다. 데이터는 배양 된 쥐 대뇌 피 질의 뉴런에서 우리가 테스트 한 모든 단백질이 성장 원뿔 영역에서 감지 가능하다는 것을 확인합니다(그림 1). 2 및 테이블 에스 4). 실제로,우리가 테스트 한 단백질은 다른 축삭 영역에서는 검출 될 수 없지만 성장 원뿔에서는 검출되지 않아 매우 낮은 위양성 비율을 제안하고 전반적인 접근 방식을 검증 할 수 있습니다. 또한,우리의 단백질 적 데이터는 전사 인자,핵 구성 요소와 오염도 무시할 수 있는 제안 포함(그림. 1 차,테이블 에스 1,및 테이블 에스 2).
그림. 2.
면역 형광 정량화. 수평 축,인터넷 비율(성장 원뿔/원위 축삭),세로 축,면적 비율(성장 원뿔/원위 축삭). 수직 검은 점선은 주어진 단백질이 원위 축삭 대 성장 원추에 고르게 분포되어 있음을 나타냅니다). 갭 43(갭 43;1.315)에 대한 인터넷 비율은 파란색 점선으로 표시됩니다. 그래프의 오른쪽 상단 영역에있는 단백질은 축삭보다 성장 원뿔에 더 집중되어 있습니다. 이들 중 다수는 액틴 결합 단백질과 소포 성 밀매에 관여하는 단백질입니다. 각 단백질의 인터넷 비율은 비교 지점으로 갭-43 을 가진 크루 스칼-윌리스 통계 테스트(46)를 사용하여 테스트되었습니다. 단백질 양면 95%신뢰 구간에 따라 그룹화 했다,즉,보다 높은,유사,또는 갭-43(빨강,파랑,검정,각각 표시)보다. 성장 원뿔보다 축삭에서 더 높은 수준에있는 튜 불린(녹색)은 그래프에서 서로 멀리 떨어져 있습니다. 자세한 내용은 표 4 를 참조하십시오.
단백질은 원위 축삭보다 성장 원추에 더 집중되어 있습니다.
우리는 다음 우리의 연구에서 확인 된 단백질은 특정 또는 로컬 성장 콘에 특정 정도 확인 하고자 했다. 이렇게 하려면,우리는 원위 축 삭에 그들의 분포와 성장 콘에 단백질의 분포를 비교 했다. 방법은 양적 범위,우리는 또한 원위 축 삭(그림 1)대 성장 콘에서 단백질의 상대적인 농도 비교할 수 있었다. 2 및 테이블 에스 4). 우리는 원위 축 삭(그림 1)에 비해 성장 콘에서 형광 강도(피)의 비율로 성장 콘 축적 인덱스를 정의. 2,표 4,시 텍스트 및 그림. 1). 우리는 또한 다른 인덱스,즉 면적 비율을 사용하여 각 단백질의 분포 패턴을 조사했습니다(그림 1). 2). 성장 콘 축적 지수는 성장 콘에서 단백질 축적의 상대적 수준을 나타내는 것입니다. 갭-43 에 비해 검사 된 단백질의 엄격한 분류를 촉진 하는 우리의 결과 통계 윌 콕 슨 순위 합계 테스트를 적용 하 여이 인덱스를 사용 하 여 체계적인 면역 염색 접근법의 우리의 정량화 밝혀 단백질 체학에 의해 확인 된 69 단백질 원위 축 삭 보다 성장 콘 영역에서 높은 수준에서 검출 되었다. 이들 단백질은 현재 확립된 성장 콘 마커 단백질 갭-43(7)보다 성장 콘에서 훨씬 더 높은 수준으로 보인다(그림 1). 2,빨간색으로 표시). 우리는 또한 발견 33 단백질에 대 한 통계적 오류 영역 갭-43 의 중복,따라서 우리는 갭-43(그림. 2,파란색으로 표시).
성장 원추의 축삭 길이 및 기능적 마커와의 관련성을 보여준다.
우리는 축삭 성장에서 마커 단백질 후보의 역할을 테스트하기 위해 알나이 기반 접근 방식을 사용했습니다. 축삭 길이를 측정하여 활동 유도 축삭 성장을 평가했습니다(시 텍스트 참조;녹다운 및 특이성의 확인을 위해 그림 1 참조). 1). 우리는 치료를 위해 68 개의 유전자를 선택했고 그 중 17 개가 붕괴되어 엄격한 비모수 테스트,즉 크루 스칼-윌리스 테스트를 적용하여 축삭 길이가 짧아 졌음을 발견했습니다(그림 1). 2014 년 11 월 1 일 우리는 추정 기능 성장 콘 마커(표 1)로 17 단백질을 분류 합니다. 정량적 면역 염색의 결과를 고려(그림. 2),이들 단백질은 갭-43 보다 농축 된 단백질로 분류 될 수 있습니다(그림 2 에서 빨간색으로 표시된 단백질). 2)또는 갭-43(그림 2 에서 파란색으로 표시된 단백질)과 유사합니다. 2). 이들 중 17 개의 단백질 중 5 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있고,1 개의 세포 골격 단백질이 있다.
그림. 3.
(에이)축삭 성장에 영향을 미치는 유전자. 성장 콘 활동에서 확인 된 단백질에 대 한 역할 축삭 성장의 감소를 유도 하 여 분석 했다. 설명 된대로 수행되었다(45). 부화 된 선의 왼쪽에있는 8 개의 단백질은 크루 스칼-윌리스 테스트를 사용하여 통계적으로 판단 된 바와 같이 갭-43 보다 우수한 인터넷 비율을 가지고 있습니다(빨간색;또한 그림 1 에서 빨간색으로 표시됨). 2),그리고 부화 된 선의 오른쪽에있는 9 개의 단백질은 동일한 시험에 의해 판단되는 갭-43 의 비율과 유사한 비율을 갖는다. (파란색;또한 그림에 파란색으로 표시. 2). 이 테스트에서 모든 것이 동일하다는 것을 알 수 있습니다. 데이터는 다음과 같이 표시됩니다. 측정 된 뉴런의 수는 각 막대의 하단에 표시됩니다. (비)면역 국지화에 의한 후보 성장 콘 마커 단백질의 분류. 우리는 정의 씨 과 피 면역 염색 이미지의 정량 분석을 사용하여 성장 원뿔의 도메인(맨 위 다이어그램;시 텍스트 및 그림 참조. 2). 우리는 4 개의 그룹으로 단백질을 분류했습니다:그룹 1(예. 1),주로 지역화 피 지역(씨 피);그룹 2(전의. Syx7),에서 검출된 모두 C P 영역(C≃P);group III(ex. 2),주로 지역화 씨 지역(씨 씨 피 피);및 그룹 4(예. 이 경우 특정 지역에서만 사용할 수 있습니다. 각각의 경우에 왼쪽 다이어그램은 각 그룹에 대한 일반적인 단백질 분포의 요약입니다. 배양된 쥐 피질 뉴런에서 항칸다데이트 단백질 항체 검출의 면역 형광 현미경 사진은 각각 마젠타 및 녹색 쇼 항원 단백질 및 투불린 뷰로 표시됩니다. 멀리 뷰는 병합 된 이미지를 보여줍니다. 3 개의 그룹(그룹 1-3)도 도 1 의 범례에 도시되어 있다. 4. 그것은 또한 성장 원뿔의 중앙 영역에서 검출되지만,그 제 2-튜 불린은 주로 축삭에서 검출된다. 각 단백질 및 약식 이름에 대한 자세한 특성은 표 1 을 참조하십시오. (스케일 바:10,000,000.)
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표 1.
신입생 후보
도에 나와있는 후보의 대부분. 3 성장 콘과 이전에 발견되지 않은 연관성을 밝혔으며 기능적으로 관련이있었습니다(표 1). 그러나 포유류 성장 원추에 있는 그들의 정확한 역할은 알려져 있지 않다. 축삭 성장(25-27)에 필요하거나 필수적인지 여부는 알려져 있지 않지만 억제제에 대한 성장 원추 반응의 조절에 관여하는 것이보고되었다. 우리의 지식의 베스트에 다른 10 단백질의 아무도는 이전에 포유류 세포 또는 무척추 동물 모델 유기 체에서 성장 콘 레 귤 레이 터를 보고 했다 비록 그들의 보조 신경 성장 관련 될 수 있습니다. 표 1 에서 이러한 단백질에 대한 현재 정보를 간략하게 요약합니다. 우리는 성장 콘 기능에 관련 된 추가 분자의 효율적인 식별에 성공 제안 축 삭 성장에 연루 되었습니다. 17 갭-43 보다 높은 또는 유사한 인터넷 비율,새로운 신경 성장 관련 단백질에 대 한 강력한 후보 만들기 4 및 30).
성장 원뿔은 중심(씨)및 주변(피)영역(31)으로 지칭되는 형태학적으로나 기능적으로 별개의 영역으로 구성된다. 기음 영역은 소포 및 미세 소관이 풍부하며 아마도 축삭 성장을위한 막 확장에 관여합니다. 피 영역은 액틴 필라멘트가 풍부하며 아마도 원동력을 생성합니다. 튜 불린을 기음 영역의 마커로 사용(그림 1 참조). 표식 단백질 4 그룹으로 분류:그룹 1,피 지역;에 주로 지역화 그룹 2,두 지역;에서 발견 그룹 3,주로 지역화 씨 지역;그리고 그룹 4,특히 씨 지역(그림. 3 비;도 참조. 2).
우리가 관찰한 현지화의 패턴은 예측된 것과 다소 달랐다. 예를 들어,액틴 1 은 세포 소기관 정렬에 관여하는 것으로보고되었지만 축삭에서 액틴 1 은 피 영역으로 국소화되며,여기서 액틴은 농축된다(그림 1). 3 비). 상용성 접합기,단백질을 스트랩으로보고되었습 다운스트림 TGF-β 신호(32)및 Clptm1,알 수 없는 막 횡단백질(33),또한 현지화에서 P 지역입니다. 반면,9 월 2 는 튜 불린 양성 영역 근처에서 발견되었지만 이전에 발견 된 것으로보고되었습니다. 또한,단백질 및 상 막 밀매 레 귤 레이 터(34),특히 씨 지역에 지역화 했다,씨-지역 마커로 잠재적으로 유용 하 게 만들기.
