Identificatie van functionele markereiwitten in de zoogdiergroeikegel

controle van de lokalisatie van de Groeikegel wijst op een verwaarloosbaar vals-positief percentage.

vervolgens wilden we de specificiteit van onze proteomicsbenadering bepalen, d.w.z., om de fout-positieve snelheid te bepalen. In het algemeen moet een vergelijking van een bepaalde fractie worden gemaakt met een andere biochemische fractie. Nochtans, kunnen geen fracties van de zich ontwikkelende hersenen met vergelijkbare zuiverheid aan GCP of GCM fracties worden voorbereid. Dus, om het genereren van een vergelijkingsdataset te vergemakkelijken, voerden we systematische immunodetectie uit van een subset van de eiwitten in gekweekte corticale neuronen (zie tabel S4, tabel S5, tabel S6 en tabel S7). We hebben alomtegenwoordige of algemeen tot expressie gebrachte eiwitten zoals metabole enzymen en moleculaire chaperones uitgesloten, zodat we ons in plaats daarvan konden concentreren op eiwitten die bijzonder relevant kunnen zijn voor groeikegel-specifieke functies. In totaal hebben we gekeken naar de verdelingen van 131 eiwitten (oftewel ≈15% van de eiwitten die we hebben geïdentificeerd). De gegevens bevestigen dat in gekweekte Rat corticale neuronen alle proteïnen die we getest hebben aantoonbaar zijn in het gebied van de groeikegel (Fig. 2 en tabel S4). Inderdaad, geen eiwitten die we getest konden worden gedetecteerd in andere axonale regio ‘ s, maar niet in de groeikegel, wat wijst op een zeer laag vals-positief percentage en het valideren van onze algemene aanpak. Bovendien bevatten onze proteomic gegevens in GCP of GCM geen transcriptiefactoren, die suggereren dat besmetting met nucleaire componenten ook verwaarloosbaar is (Fig. 1D, tabel S1, en tabel S2).

eiwitten die meer geconcentreerd zijn in de Groeikegel dan in het distale Axon.

vervolgens probeerden we te bepalen in welke mate de eiwitten die in onze studie werden geïdentificeerd specifiek of lokaal specifiek zijn voor de groeikegel. Om dit te doen, vergeleken we de distributies van de eiwitten in groeikegels met hun distributie in distale axonen. Voor zover de methode kwantitatief is, konden we ook de relatieve concentraties van eiwitten in groeikegels vergelijken met distale axonen (Fig. 2 en tabel S4). We definieerden de groeikegel accumulatie index als de verhouding van fluorescentie intensiteit (FI) in de groeikegel vergeleken met die in het distale axon (Fig. 2, Tabel S4, SI-tekst en Fig. S1). We gebruikten ook een andere index, dat wil zeggen, de oppervlakte ratio, om de distributiepatronen van elk eiwit te onderzoeken (Fig. S2). De groeikegelaccumulatie-index is een indicatie van het relatieve niveau van eiwitaccumulatie in de groeikegel. Door de statistische Wilcoxon rank-sum test op onze resultaten toe te passen, die strikte classificatie van de onderzochte proteã nen in vergelijking met GAP-43 vergemakkelijkt, onthulde onze kwantificering van de systematische immunostaining benadering gebruikend deze index dat maar liefst 69 proteã nen door proteomics werden geïdentificeerd op hogere niveaus in het gebied van de groeikegel dan in het distale axon werden ontdekt. Deze proteã nen schijnen op veel hogere niveaus in groeikegels te zijn dan de momenteel vastgestelde groeikegel marker eiwit GAP-43 (7) (Fig. 2, weergegeven in rood). Wij vonden ook dat Voor 33 proteã nen de statistische foutgebieden met die van GAP-43 overlappen, zo categoriseren wij deze reeks proteã nen als geconcentreerd in de groeikegel in een gelijkaardige graad als GAP-43 is (Fig. 2, weergegeven in blauw).

RNAi analyse toont relevantie voor Axon lengte en functionele Markers van de Groeikegel.

we gebruikten een op RNAi gebaseerde benadering om de rollen van marker eiwitkandidaten in axonale groei te testen. Activiteit-inducerende axonale groei werd beoordeeld door de axonale lengte te meten (zie SI-tekst; voor bevestiging van knockdown en specificiteit, zie ook Fig. S1). We selecteerden 68 genen voor RNAi behandeling en vonden dat verstoring van 17 van hen leidde tot kortere axonale lengte, door toepassing van een strenge niet-parametrische test, dat wil zeggen, de Kruskal-Willis test (Fig. 3A, Tabel 1, en tabel S8). We categoriseren de 17 eiwitten als veronderstelde functionele groeikegel markers (Tabel 1). Gezien de resultaten van de kwantitatieve immunostaining (Fig. 2), kunnen deze proteã nen in proteã nen worden geclassificeerd meer geconcentreerd dan GAP-43 (proteã nen in rood in Fig. 2) of gelijkaardig aan GAP-43 (proteã nen getoond in blauw in Fig. 2). Van deze 17 eiwitten, er zijn vijf cytoskelet eiwitten (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb, en 2 Sept), vier het membraan van mensenhandel eiwitten (Pacs1, Stx7, Snap25a, en Rtn1), twee GTP-bindende eiwitten (Gnai2, Gnao1), twee eiwitten die betrokken zijn bij kleine G eiwit signalering (Farp2 en Cyfip1), drie signalering adapter eiwitten (Riem, FABP7, en Crmp1), en één kandidaat-receptor (Clptm1).

de meeste in Fig. 3A onthulde eerder niet-ontdekte associaties met groeikegels en waren functioneel gerelateerd (Tabel 1). Sept2, Cap1( een G-actin-bindende proteã ne), Snap25a, en Cyfip1 zijn voorgesteld om rollen in het gedrag van de groeikegel te spelen, die op studies in PC12 cellen of kuiken of de neuronen van de Drosophila (21-24) worden gebaseerd, maar hun nauwkeurige rollen in de kegel van de zoogdiergroei zijn niet gekend. Voor de twee GTP-bindende eiwitten (Gnai2, Gnao1) en de regulator (Farp2) is betrokkenheid bij de regulatie van een groeikegelrespons op remmers gemeld, hoewel niet bekend is of ze noodzakelijk of onmisbaar zijn voor axonale groei (25-27). Naar beste weten, werden geen van de andere 10 proteã nen eerder gemeld om de regelgevers van de groeikegel in zoogdiercellen of ongewervelde modelorganismen zoals C. elegans of Drosophila te zijn, hoewel hun paralogen met neurietgroei kunnen worden gerelateerd . We vatten de huidige informatie over deze eiwitten kort samen in Tabel 1. Hoogstens 3 van de 17 proteã nen die in onze studie worden geà dentificeerd en met RNAi worden getest zijn eerder betrokken bij axonale groei, die voorstellen dat wij in efficiënte identificatie van extra molecules betrokken bij de functies van de groeikegel zijn geslaagd. In totaal, wijzen de resultaten van RNAi analyse aan 17 proteã nen met hogere of gelijkaardige Fi verhoudingen dan GAP-43, die hen sterke kandidaten voor nieuwe neuronale groei-geassocieerde proteã nen maken (nGAPs; refs. 4 en 30).

de groeikegel bestaat uit morfologisch en functioneel onderscheiden regio ‘s, aangeduid als de centrale (C) en perifere (P) regio’ s (31). Het C-gebied wordt verrijkt in blaasjes en microtubules en is waarschijnlijk betrokken bij membraanuitbreiding voor axonale groei. Het P-gebied wordt verrijkt in actin filamenten en produceert waarschijnlijk drijfkracht. Tubuline gebruiken als marker voor het C-gebied (zie Fig. S3), classificeerden we de markerproteã nen in vier groepen: Groep I, voornamelijk gelokaliseerd in het P-gebied; groep II, gedetecteerd in beide gebieden; groep III, voornamelijk gelokaliseerd in het C-gebied; en groep IV, specifiek gelokaliseerd in het C-gebied (Fig. 3B; zie ook vijgen. S3 en S4).

de patronen van lokalisatie die we observeerden waren enigszins verschillend van wat voorspeld had kunnen worden. Pacs1 is bijvoorbeeld betrokken bij het sorteren van organellen, maar in axonen lokaliseert Pacs1 zich in het P-gebied, waar F-actine is verrijkt (Fig. 3B). Een vermoedelijk oplosbare adapterproteã ne, riem, die als stroomafwaarts van TGF-β het signaleren (32) is gemeld, en Clptm1, een onbekende transmembraanproteã ne (33), zijn ook gelokaliseerd in het P-gebied. Daarentegen wordt Sept 2 ontdekt in de buurt van het tubuline-positieve gebied, ondanks het feit dat het eerder werd gemeld te worden gevonden in het P-domein in PC12-cellen (21). Alleen Rtn1, een ER eiwit en vermeende membraanhandel regulator (34), werd specifiek gelokaliseerd in het C-gebied, waardoor het potentieel nuttig is als een C-regio marker.