Identificarea proteinelor markerului funcțional în conul de creștere al mamiferelor

verificarea localizării conului de creștere sugerează o rată fals pozitivă neglijabilă.

am vrut apoi să determinăm specificitatea abordării noastre proteomice, adică să determinăm rata fals pozitivă. În general, ar trebui făcută o comparație a unei fracții date cu o altă fracție biochimică. Cu toate acestea, nici o fracțiune din creierul în curs de dezvoltare nu poate fi preparată cu o puritate comparabilă cu fracțiile GCP sau GCM. Astfel, pentru a facilita generarea unui set de date de comparație, am efectuat imunodetecția sistematică a unui subset de proteine din neuronii corticali cultivați (vezi Tabelul S4, tabelul S5, tabelul S6 și tabelul S7). Am exclus proteinele omniprezente sau exprimate în mod obișnuit, cum ar fi enzimele metabolice și chaperonele moleculare, astfel încât să ne putem concentra în schimb pe proteine care pot fi deosebit de relevante pentru funcțiile specifice conului de creștere. În total, am analizat distribuțiile a 131 de proteine (adică 15% din proteinele pe care le-am identificat). Datele confirmă faptul că în neuronii corticali de șobolan cultivați toate proteinele testate sunt detectabile în zona conului de creștere (Fig. 2 și tabelul S4). Într-adevăr, nici o proteină pe care am testat-o nu a putut fi detectată în alte regiuni axonale, dar nu în conul de creștere, sugerând o rată fals pozitivă foarte scăzută și validând abordarea noastră generală. În plus, datele noastre proteomice din GCP sau GCM nu conțineau factori de transcripție, sugerând că contaminarea cu componente nucleare este, de asemenea, neglijabilă (Fig. 1D, tabelul S1 și tabelul S2).

proteine mai concentrate în conul de creștere decât în axonul Distal.

în continuare am căutat să determinăm măsura în care proteinele identificate în studiul nostru sunt specifice sau locale specifice conului de creștere. Pentru a face acest lucru, am comparat distribuțiile proteinelor din conurile de creștere cu distribuția lor în axonii distali. În măsura în care metoda este cantitativă, am putut compara și concentrațiile relative ale proteinelor din conurile de creștere față de axonii distali (Fig. 2 și tabelul S4). Am definit indicele de acumulare a conului de creștere ca raport al intensității fluorescenței (FI) în conul de creștere comparativ cu cel din axonul distal (Fig. 2, Tabelul S4, textul SI și Fig. S1). De asemenea, am folosit un alt indice, adică raportul ariei, pentru a examina modelele de distribuție ale fiecărei proteine (Fig. S2). Indicele de acumulare a conului de creștere este o indicație a nivelului relativ de acumulare a proteinelor în conul de creștere. Prin aplicarea testului statistic Wilcoxon rank-sum la rezultatele noastre, facilitând clasificarea strictă a proteinelor examinate în comparație cu GAP-43, cuantificarea noastră a abordării sistematice imunosupresoare folosind acest indice a arătat că până la 69 de proteine identificate prin proteomică au fost detectate la niveluri mai ridicate în zona conului de creștere decât în axonul distal. Aceste proteine par a fi la niveluri mult mai ridicate în conurile de creștere decât markerul proteic gap-43 (7) al conului de creștere stabilit în prezent (Fig. 2, prezentat în roșu). De asemenea, am constatat că pentru 33 de proteine zonele de eroare statistică se suprapun cu cele ale GAP-43, astfel clasificăm acest set de proteine ca fiind concentrat în conul de creștere într-un grad similar cu GAP-43 (Fig. 2, prezentat în albastru).

analiza RNAi relevă relevanța pentru lungimea axonului și markerii funcționali ai conului de creștere.

am folosit o abordare bazată pe RNAi pentru a testa rolurile candidaților la proteinele marker în creșterea axonală. Creșterea axonală care induce activitatea a fost evaluată prin măsurarea lungimii axonale (vezi textul SI; pentru confirmarea loviturii și specificității, vezi și Fig. S1). Am selectat 68 de gene pentru tratamentul RNAi și am constatat că întreruperea a 17 dintre ele a dus la o lungime axonală mai scurtă, prin aplicarea unui test neparametric strict, adică testul Kruskal-Willis (Fig. 3a, Tabelul 1 și tabelul S8). Clasificăm cele 17 proteine ca markeri funcționali ai conului de creștere (Tabelul 1). Având în vedere rezultatele imunostimulării cantitative (Fig. 2), aceste proteine pot fi clasificate în proteine mai concentrate decât GAP-43 (proteine prezentate în roșu în Fig. 2) sau similar cu GAP-43 (proteine prezentate în albastru în Fig. 2). Dintre aceste 17 proteine, există cinci proteine citoscheletice (Tmod2, Cap1, Cotl1, CapZb și Sept 2), patru proteine de trafic cu membrană (Pacs1, Stx7, Snap25a și Rtn1), două proteine care leagă GTP (Gnai2, Gnao1), două proteine implicate în semnalizarea proteinei g mici (Farp2 și Cyfip1), trei proteine adaptoare de semnalizare (Strap, FABP7 și Crmp1) și un candidat receptor (Clptm1).

majoritatea candidaților enumerați în Fig. 3A a evidențiat asocieri nedetectate anterior cu conuri de creștere și au fost legate funcțional (Tabelul 1). S-a sugerat că Sept2, Cap1 (o proteină care leagă g-actina), Snap25a și Cyfip1 joacă roluri în comportamentul conului de creștere, pe baza studiilor efectuate pe celule PC12 sau neuroni de pui sau Drosophila (21-24), dar rolurile lor precise în conul de creștere al mamiferelor nu sunt cunoscute. Pentru cele două proteine care leagă GTP (Gnai2, Gnao1) și regulatorul (Farp2), a fost raportată implicarea în reglarea unui răspuns Conic de creștere la inhibitori, deși nu se știe dacă acestea sunt necesare sau indispensabile pentru creșterea axonală (25-27). Din câte știm, niciuna dintre celelalte 10 proteine nu a fost raportată anterior a fi regulatori ai conului de creștere în celulele mamiferelor sau în organismele model nevertebrate, cum ar fi C. elegans sau Drosophila, deși paralogii lor pot fi legați de creșterea neuritei . Rezumăm pe scurt informațiile actuale despre aceste proteine în tabelul 1. Cel mult 3 din cele 17 proteine identificate în studiul nostru și testate cu RNAi au fost implicate anterior în creșterea axonală, sugerând că am reușit identificarea eficientă a moleculelor suplimentare implicate în funcțiile conului de creștere. În total, rezultatele analizei RNAi indică 17 proteine cu raporturi FI mai mari sau similare decât GAP-43, făcându-le candidați puternici pentru noi proteine asociate creșterii neuronale (nGAPs; refs. 4 și 30).

conul de creștere este format din regiuni distincte morfologic și funcțional denumite regiuni centrale (C) și periferice (P) (31). Regiunea C este îmbogățită în vezicule și microtubuli și este probabil implicată în expansiunea membranei pentru creșterea axonală. Regiunea P este îmbogățită în filamente de actină și probabil generează forță motrice. Utilizarea tubulinei ca marker pentru regiunea C (vezi Fig. S3), am clasificat proteinele marker în patru grupe: Grupa I, localizată predominant în regiunea P; grupa II, detectată în ambele regiuni; grupa III, localizată predominant în regiunea C; și grupa IV, localizată specific în regiunea C (Fig. 3B; vezi și smochine. S3 și S4).

modelele de localizare pe care le-am observat au fost oarecum diferite de ceea ce ar fi putut fi prezis. De exemplu, Pacs1 a fost raportat a fi implicat în sortarea organelelor, dar în axoni, Pacs1 se localizează în regiunea P, unde F-actina este îmbogățită (Fig. 3B). O proteină adaptoare solubilă presupusă, curea, care a fost raportată ca în aval de semnalizarea TGF-Irak (32) și Clptm1, o proteină transmembranară necunoscută (33), Sunt, de asemenea, localizate în regiunea P. În schimb, Sept 2 este detectat în apropierea regiunii tubulinice pozitive, în ciuda faptului că a fost raportat anterior că se găsește în domeniul P în celulele PC12 (21). Numai Rtn1, o proteină ER și regulator de trafic cu membrană putativă (34), a fost localizat în mod specific în regiunea C, făcându-l potențial util ca marker al regiunii C.